張再永 馬俊美 李強 范斌 劉亮

摘 要：建立通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測豬肉和牛肉中9 種類固醇激素的方法。樣品于37 ℃酶解16 h，乙腈渦旋提取后，經(jīng)新型PRiME HLB通過式固相萃取小柱凈化，采用Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）分離，以體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫，使用電噴霧離子源正離子模式檢測，內(nèi)標法定量。結果表明：9 種類固醇激素在0.2～100.0 ng/mL質量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，檢出限為0.2～0.5 μg/kg，定量限為0.4～1.0 μg/kg;方法回收率為84.5%～117.3%，相對標準偏差小于10%。該方法操作簡便且靈敏度高，適用于豬肉和牛肉中9 種類固醇激素的定量分析。

關鍵詞：通過式固相萃取;超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法;類固醇激素;內(nèi)標法

Abstract： A method for determination of 9 steroid hormones in pork and beef was developed by filtration solid phase extraction （FSPE） followed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Samples were digested for 16 h at 37 ℃， extracted with acetonitrile， and purified by a PRiME HLB cartridge. Then the analytes were separated on a Waters Acquity BEH C18 column （2.1 mm × 100 mm，2.5 μm） by gradient elution using a mixture of 0.1% formic acid solution and acetonitrile as the mobile phase. The detection was operated using an electrospray ionization source in the positive mode， and quantitation was performed by the internal standard method. The results showed that the nine steroid hormones had a good linear relationship in the concentration range of 0.2–100.0 ng/mL. The limits of detection and limits of quantitation were respectively 0.2–0.5 and 0.4–1.0 μg/kg. Recoveries of the method were in the range of 84.5%–117.3%， with relative standard deviation （RSD） lower than 10%. The method is simple， sensitive， and useful for quantification of 9 steroid hormones in pork and beef samples.

Keywords： filtration solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; steroid hormones; internal standard method

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200429-109

中圖分類號：O657.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）07-0058-06

引文格式：

張再永， 馬俊美， 李強， 等. 通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豬肉和牛肉中9 種類固醇激素[J]. 肉類研究， 2020， 34（7）： 58-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200429-109.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Zaiyong， MA Junmei， LI Qiang， et al. Determination of 9 steroid hormones in pork and beef samples by filtration solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2020， 34（7）： 58-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200429-109.? ? http：//www.rlyj.net.cn

類固醇激素是一類具有較強抗炎和蛋白同化作用的四環(huán)脂肪烴化合物[1-2]，能促進動物超常態(tài)生長[3]，提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，但在動物體內(nèi)不易被分解，通過食物鏈進入人體后，會導致機體代謝紊亂，甚至可導致發(fā)育異?；虬┌Y、畸形等[4-6]。因此，世界各國對類固醇激素采取禁用或限用，但動物源性食品中類固醇激素殘留問題時有發(fā)生，我國在風險監(jiān)測和監(jiān)督抽查中多次發(fā)現(xiàn)動物源性食品中類固醇激素殘留的現(xiàn)象，曾一度影響我國動物源性食品的出口量。因此，為保障消費者健康以及我國進出口貿(mào)易往來，建立具有高靈敏度、高選擇性的動物源性食品中類固醇激素檢測技術具有重要意義。

目前，動物源性食品中類固醇激素的檢測方法主要包括液相色譜法[7]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[8]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-13]。液相色譜法的靈敏度較差[14];氣相色譜-質譜聯(lián)用法需對目標物進行衍生化，前處理過程較繁瑣[15];液相色譜-串聯(lián)質譜法靈敏度高、特異性好，已成為動物源性食品中類固醇激素檢測的首選方法[16-19]。目前，國內(nèi)外已有類固醇激素檢測的文獻[20-22]與標準[23-25]，雖然這些方法能滿足檢測要求的回收率和準確度，但大多采用傳統(tǒng)固相萃取、液-液萃取的凈化方式，或缺乏樣品凈化步驟[26-30]。豬肉和牛肉基質較為復雜，不經(jīng)凈化步驟或凈化方式較為簡單容易對目標物造成干擾，損耗色譜柱壽命，對質譜造成污染。傳統(tǒng)固相萃取與液-液萃取的凈化方式操作復雜、耗時長且試劑消耗量大。本研究采用PRiME HLB新型固相萃取小柱，不需要活化、淋洗、洗脫等步驟，可直接將樣品中的脂肪等非極性干擾物吸附在填料內(nèi)，將目標化合物過濾到進樣瓶中，有效簡化了前處理步驟，提高了檢測效率。本研究將該技術與超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法相結合，建立豬肉和牛肉中9 種類固醇激素的檢測方法，且采用同位素內(nèi)標法定量，保證檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉和牛肉樣品購自當?shù)爻小?/p>

司坦唑醇（純度99.88%）、美雄酮（純度95.00%）、睪酮（純度99.20%）、丙酸睪酮（純度99.73%）、丙酸諾龍（純度98.68%）、苯丙酸諾龍（純度99.10%）、甲基睪酮（純度98.30%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;群勃龍（99.9 μg/mL）、諾龍（100 μg/mL）、睪酮-D3（100 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司;乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）?美國Fisher公司;超純水 廣州屈臣氏有限公司。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX Triple Quad 6500超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（配有MultiQuant 3.0.1數(shù)據(jù)處理軟件、電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源） 美國Sciex公司;CR22N高速冷凍離心機 德國Hitachi公司;Elmasonic P300H超聲波清洗器 德國Elma公司;SHA-B恒溫水浴振蕩搖床 常州潤華電器有限公司;Vortex Genius 3漩渦混合器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別稱取司坦唑醇、美雄酮、睪酮、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、甲基睪酮標準品至棕色容量瓶中，用甲醇定容，得到質量濃度為100 μg/mL的標準儲備溶液，于-20 ℃保存，有效期6 個月。量取適量的司坦唑醇、美雄酮、睪酮、丙酸睪酮、丙酸諾龍、苯丙酸諾龍、甲基睪酮標準儲備溶液和群勃龍、諾龍、睪酮-D3標準物質溶液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的9 種激素混合標準中間溶液和內(nèi)標中間溶液，于-4 ℃保存，有效期1 個月。

1.3.2 樣品前處理

將樣品充分絞碎混勻后，裝入潔凈的容器內(nèi)。稱取5 g（精確至0.001 g）試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5.0 μL睪酮-D3內(nèi)標中間溶液和5 mL乙酸銨緩沖溶液（pH 5.2），再加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶20 μL，渦旋混勻，于37 ℃振蕩酶解16 h;取出冷卻至室溫，加入10 mL乙腈，超聲提取20 min后，加入2 g氯化鈉，渦旋混勻1 min，9 000 r/min離心5 min;吸取約3 mL上清液，使其通過PRiME HLB固相萃取柱并棄去濾液，再取1 mL上清液，再次通過小柱并收集流出液，將收集到的流出液過0.22 ?m再生纖維素濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）;柱溫35 ℃;進樣量2.0 μL;流動相A：體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈;流速0.25 mL/min;洗脫程序：0～1.00 min，流動相B體積分數(shù)20%;1.00～4.00 min，流動相B體積分數(shù)20%～90%;4.00～6.00 min，流動相B體積分數(shù)90%;6.00～6.10 min，流動相B體積分數(shù)90%～20%;6.10～7.00 min，流動相B體積分數(shù)20%。

1.3.4 質譜條件

離子源：ESI+;掃描方式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），離子化電壓5.5 kV，離子源溫度550 ℃，氣簾氣壓力206.8 kPa，霧化器壓力344.7 kPa，輔助氣壓力344.7 kPa。9 種類固醇激素定性離子、定量離子對的MRM參數(shù)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1專業(yè)制圖軟件（美國Originlab公司）進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

部分類固醇激素在動物體內(nèi)以結合態(tài)存在，酶解可促進類固醇激素水解成游離態(tài)，從而提高樣品中類固醇激素的提取效率。類固醇激素屬于脂溶性化合物，極性較弱，難溶于水，易溶于極性有機溶劑。類固醇激素的常用提取溶劑為叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇[26-30]等，考察上述4 種試劑對9 種類固醇激素的提取效果。

由圖1可知，乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為提取溶劑時的回收率較低，不及甲醇和乙腈。但甲醇作為提取溶劑時，提取溶液渾濁，乙腈作為提取溶劑時，可有效去除豬肉和牛肉基質中的蛋白質，故選用乙腈用作提取溶劑。

PRiME HLB通過式固相萃取小柱可以將豬肉和牛肉基質中的脂肪等干擾物去除，且操作簡單，適用于大批量豬肉和牛肉樣品中類固醇激素的檢測。比較吸取不同體積（1、2、3、4 mL）上清液通過PRiME HLB固相萃取柱并棄去，再取1 mL上清液通過小柱并收集流出液的凈化效果。

由圖2可知：首次上樣體積為1、2 mL時，再取1 mL上清液，收集得到的流出液中目標物回收率較低，這可能是由于此體積下，固相萃取小柱對分析物的吸附未達到飽和，小柱對分析物的吸附造成回收率偏低;首次上樣體積為3、4 mL時，再取1 mL上清液，收集得到的流出液中目標物回收率大致相同?？紤]到隨著上樣體積的增加，固相萃取小柱對樣品的凈化效果可能變差，故選擇首次上樣體積為3 mL。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察9 種類固醇激素在Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）、Thermo Accucorea Q?C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）、Hypersil Gold C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）上的峰型，結果顯示，采用Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）得到的9 種類固醇激素峰型最佳，尖銳且對稱。故選擇Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）。

考察水-甲醇、水-乙腈、體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相時，9 種類固醇激素的色譜峰峰型和信號響應情況。結果表明：使用水-乙腈體系作為流動相得到的色譜峰峰型優(yōu)于水-甲醇體系，且柱壓較低;相比于水-乙腈體系，使用體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動相時9 種類固醇激素的峰面積變大，穩(wěn)定性也較好。這是由于在正離子模式條件下，加入甲酸能促進待測物離子化，從而提高信號強度。故選用體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相。

2.3 質譜參數(shù)的優(yōu)化

通過流動注射泵連續(xù)進樣的方式，將10 種化合物標準溶液（100 ng/mL）以5 μL/min的速率直接注入質譜儀中，分別采用正離子（ESI+）和負離子（ESI-）模式對目標物進行全掃描，最終確定采用正離子（ESI+）模式。在ESI+模式下對目標物進行Q1 MS一級全掃描，確定母離子，對母離子進行Production二級掃描，確定定量子離子和定性子離子，再選擇MRM模式，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量等質譜參數(shù)。優(yōu)化條件下目標物的MRM色譜圖如圖3所示。

2.4 方法的線性關系、檢出限和定量限

準確吸取9 種激素混合標準中間溶液和內(nèi)標中間溶液，用乙腈配制系列標準溶液，內(nèi)標質量濃度為10 ng/L，采用空白基質加標的方法確定方法的檢出限和定量限，信噪比RS/N=3和RS/N=10時對應的質量濃度分別作為檢出限和定量限。

由表2可知，9 種類固醇激素在0.2～100.0 ng/mL質量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（R2）≥0.999 0，檢出限為0.2～0.5 μg/kg，定量限為0.4～1.0 μg/kg。

2.5 加標回收率

在空白豬肉和牛肉基質中添加9 種類固醇激素進行加標回收率實驗，共添加3 個水平，每個水平重復測定6 次。由表3可知，9 種類固醇激素在豬肉基質中加標回收率為84.5%～117.3%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.49%～6.29%，在牛肉基質中加標回收率為84.9%～112.9%，RSD為0.79%～7.01%。

2.6 實際樣品測定

應用本研究建立的方法對市場采購的20 批次豬肉和牛肉樣品進行檢測，檢測結果均為陰性。

3 結 論

本研究基于通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術，建立豬肉和牛肉中9 種類固醇激素的檢測方法，酶解后的樣品經(jīng)乙腈提取后，采用PRiME HLB通過式固相萃取小柱凈化，用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜結合內(nèi)標法校正。結果表明，該方法前處理提取率高，條件易于控制，方法靈敏度高，重復性好，適用于豬肉和牛肉中9 種類固醇激素的檢測，也可為其他動物源性食品及化妝品中類固醇激素含量的測定提供參考。

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