阿日查 斯木吉德 王純潔 張 劍 陳 浩 劉 波 何利娜 張 晨 崔銀雪 敖日格樂*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

蒙古牛是一個古老的馴化畜種，其祖先為亞洲野牛[1]。原產(chǎn)于蒙古高原地區(qū),現(xiàn)廣泛分布于內(nèi)蒙古、新疆和甘肅等地區(qū)。在內(nèi)蒙古地區(qū)，錫林郭勒盟的蒙古牛數(shù)量最多，錫林郭勒草原屬北部溫帶大陸性氣候，主要氣候特點是風(fēng)大、干旱和寒冷[2]。年平均氣溫3.1 ℃，寒冷期長達(dá)7個月，1月氣溫最低，極端最低氣溫可達(dá)-42.4 ℃，為華北最冷的地區(qū)之一。在極為寒冷的冬季，牧草雖處于枯草期，但自然放牧且無補(bǔ)飼條件下蒙古牛依然正常生存，并具有較高的生產(chǎn)性能和遺傳穩(wěn)定性[3]。經(jīng)當(dāng)?shù)啬撩耖L期適應(yīng)性選擇后，蒙古牛逐漸形成了抗寒、抗病、耐粗飼和適應(yīng)性強(qiáng)等特點，這些優(yōu)良特征使其成為蒙古高原的優(yōu)勢畜種之一。

哺乳動物的腸道是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，由多種多樣的微生物群組成[4]。腸道菌群是機(jī)體正常菌群的重要組成部分，它們對宿主的疾病或健康狀態(tài)下的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系[5]。與宿主漫長的進(jìn)化過程中，可直接參與宿主食物的消化、能量代謝和營養(yǎng)吸收等多種生理活動，相當(dāng)于一個后天的重要器官[6-7]。目前，腸道微生物在草食性反芻動物中研究較為廣泛，如綿羊[8]、牦牛[9]和肉牛[10]等。健康機(jī)體的腸道菌群相對穩(wěn)定，但由于飲食、環(huán)境(溫度變化)及季節(jié)的不同，其菌群多樣性會發(fā)生動態(tài)變化[11-15]。淡瑞芳等[16]在研究不同季節(jié)綿羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的季節(jié)性動態(tài)變化時發(fā)現(xiàn)，其冬季瘤胃細(xì)菌豐度顯著低于秋季。劉春朋等[17]研究表明，急慢性冷應(yīng)激會改變鵪鶉十二指腸內(nèi)腸道菌群的數(shù)量和種類。冷應(yīng)激3、6和12 h時鵪鶉十二指腸內(nèi)逐漸出現(xiàn)新的菌群且產(chǎn)生了波動性的變化。在急慢性冷應(yīng)激時，雛雞腸道大腸桿菌呈逐漸增多，而乳酸桿菌含量下降[18]。Li等[19]比較春季和夏季奶牛的糞便微生物多樣性時發(fā)現(xiàn)，夏季熱應(yīng)激時，微生物豐度Chao1和ACE指數(shù)呈下降趨勢，夏季的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)明顯低于春季，春季奶牛糞便中微生物的種類數(shù)量高于夏季，該研究揭示動物腸道微生物多樣性受季節(jié)因素的影響。然而，在自然放牧而無補(bǔ)飼條件下，季節(jié)因素對蒙古牛腸道微生物多樣性的影響迄今尚未報道。本研究以冬季自然放牧而無補(bǔ)飼條件的蒙古牛腸道微生物為研究對象，利用16S rRNA Illumina Hiseq測序，監(jiān)測食物短缺的冬季放牧蒙古牛腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)的變化，以期為深入研究放牧蒙古牛腸道微生物的組成與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和腸道健康之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點及時間

分別于2018年11月28日、12月27日和2019年1月30日在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗滿都拉圖鎮(zhèn)某牧戶家的牧場進(jìn)行樣品采集。

1.2 試驗動物及糞便樣品采集

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗滿都拉圖鎮(zhèn)某牧戶家提供的20頭3～4齡健康無病的放牧蒙古母牛為試驗動物。其常年自然放牧，自由采食牧草和飲水，無補(bǔ)飼情況。采集蒙古牛新鮮直腸糞樣于無菌管中，放置液氮罐送回實驗室于-80 ℃，待檢。

1.3 牧草樣品采集

跟隨放牧牛群，采集(1.0 m×1.0 m)樣方牧草(芨芨草、錦雞兒、沙蔥和針茅)。除去雜質(zhì)將其自然風(fēng)干，帶回實驗室粉碎，進(jìn)行牧草營養(yǎng)成分的測定。其測定方法參照張麗英[20]的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》。

1.4 采樣地點氣候特征

表1 試驗地點氣候特征Table 1 Climatic characteristics of study site

1.5 糞便樣品高通量測序分析

利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對糞便樣品基因組DNA進(jìn)行提取[21]，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，擴(kuò)增其 16S rRNA V3～V4高變區(qū)，特異性引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR擴(kuò)增及Illumina Hiseq測序均由北京諾禾致源科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.6 生物信息

操作單元OTU聚類分析數(shù)據(jù)經(jīng)過濾和質(zhì)控后，對所有樣品的全部有效序列進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為1個操作分類單元(OTUs)。對OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法進(jìn)行物種注釋分析，在門和科分類水平上，統(tǒng)計樣品的物種豐度和多樣性。

LEfSe是一種基于線性判別分析(Linear discriminant analysis,LDA)效應(yīng)量(Effective size)[22]的分析方法，其本質(zhì)是篩選關(guān)鍵的生物標(biāo)記物。LEfSe能自動對各分類水平的組成進(jìn)行統(tǒng)計分析，并將其可視化，默認(rèn)設(shè)置線性判別分析值(LDA Score)的篩選值為4。

利用QIIme(Version 1.9.1)軟件計算α多樣性，包括Chao1指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。其中Chao1指數(shù)和ACE 指數(shù)計算菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)計算菌群多樣性。

利用β多樣性分析評價樣品在物種復(fù)雜性方面的差異，對OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principle coordination analysis，PCoA),使用層次聚類方法非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對距離矩陣進(jìn)行解釋，結(jié)合細(xì)菌群落柱狀圖，研究不同組間或樣品間的菌群相似性和分類學(xué)差異性。

PICRUSt(Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)是基于以測細(xì)菌16S rRNA的測序數(shù)據(jù)，對糞便微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測[23]。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行前期處理，后使用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05 為差異不顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間點牧草營養(yǎng)成分的變化

由表2可知，11月份牧草中的粗蛋白和酸性洗滌纖維顯著高于其他時間點(P<0.05)；中性洗滌纖維顯著低于其他時間點(P<0.05)。次年1月份牧草中的中性洗滌纖維最高，粗蛋白最低。牧草中中性洗滌纖維的含量隨著試驗時間的變化逐漸增加，粗蛋白、粗脂肪和酸性洗滌纖維的含量隨著試驗時間的變化逐漸減少，粗脂肪含量在各時間點差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同時間點混合牧草的營養(yǎng)水平Table 2 Nutrient levels of mixed pastures at different time points %

2.2 不同時間點蒙古牛腸道微生物α多樣性指數(shù)

基于Illumina HiSeq 測序平臺對細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4高變區(qū)測序分析，60份樣品平均每個樣品測得90 075條有效序列，經(jīng)過質(zhì)控平均得到 83 870條序列，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)63 802條序列，質(zhì)控有效率達(dá)70.81%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到3 975個OTUs，對OTUs序列與Silva132數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋。注釋結(jié)果中，84.60%的OTU注釋到門水平，65.08%的OTU注釋到科水平，29.56%的OTU注釋到屬水平。

通過繪制稀疏曲線來評判測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性(圖1)，隨著測序深度的增加，在測序量達(dá)到30 000時，曲線趨向平坦，說明取樣的數(shù)量合理，測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，且能夠很好地反映出所有樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

不同的樣品用不同顏色的曲線表示Different samples were represented by different color curves圖1 60份樣品的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of 60 samples

表3顯示了不同時間點放牧蒙古牛腸道菌群α多樣性指數(shù)，直接反映微生物群落的豐度及多樣性。Shannon和Simpson指數(shù)表示菌群多樣性；Chao1和ACE指數(shù)表示菌群豐度；覆蓋率表示樣本的測序深度。由表2可知，所有樣本覆蓋率在99.1%～99.3%之間，表明測序深度足以檢測糞便樣本中的微生物群落信息。Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)在11月時蒙古牛樣品中高于其他時間點，次年1月時數(shù)值最小，表明11月時蒙古牛樣品中微生物群落的豐度及多樣性相對較高，隨著天氣變冷蒙古牛糞便中微生物群落豐度及多樣性隨著減少。

表3 不同時間點放牧蒙古牛腸道菌群α多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indexes of intestinal flora of grazing Mongolian cattle among different time points

2.3 不同時間點放牧蒙古牛腸道微生物β多樣性分析

基于加權(quán)的UniFrac距離進(jìn)行了PCoA分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育UPGMA聚類樹,分析樣品間微生物的相似性。由圖2可知，主成分PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為總變量的41.89%和16.55%，11和12月時的放牧蒙古牛樣本相互聚集在一起，而次年1月時的蒙古牛樣本則離散的較遠(yuǎn)，單獨聚為一簇，說明寒冷的次年1月時的樣本微生物群落組成與其他時間點差異性較大?；诩訖?quán)的UniFrac距離計算后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹UPGMA聚類樹得出了與PCoA分析相似的結(jié)論(圖3)，次年1月的樣本與11和12月能夠明顯的區(qū)分開，11和12月的樣品聚為一類，說明這兩個時間點菌群組成有一定相似性。而與次年1月時具有差異性，這可能是由于次年1月時天氣最為寒冷，牧草營養(yǎng)價值低，從而導(dǎo)致與其他時間點的蒙古牛樣本的細(xì)菌多樣性產(chǎn)生差異。

PC1值為41.89%，則表示x軸的差異可以解釋全面分析結(jié)果的41.89%；PC2值為16.55%，則表示y軸的差異可以解釋全面分析結(jié)果的16.55%；圖中的每個點表示一個樣品，同一組的樣品用同一種顏色表示。The PC1 value is 41.89%,which means that the x-axis difference can explain 41.89% of the comprehensive analysis results;The PC2 value is 16.55%,which means that the difference on the y-axis can explain 16.55% of the comprehensive analysis results;Each point in the diagram represents a sample,and the samples of the same group are shown in the same color.圖2 不同時間點放牧蒙古牛樣本主坐標(biāo)PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of the grazing Mongolian cattle among different time points

2.4 不同時間點蒙古牛腸道菌群門分類水平下的結(jié)構(gòu)

通過物種注釋后，在門分類水平上，選擇了豐度排名前10的物種。由表4可知，不同時間點蒙古牛腸道中占據(jù)主導(dǎo)地位的菌群主要包括厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，11、12月和次年1月厚壁菌門的豐度分別為61.83%、57.66%、54.84%；擬桿菌門的豐度分別為32.33%、32.55%和37.87%。其次分別為放線菌門(Actinobacteria)(0.38%、1.10%和0.70%)、變形菌門(Proteobacteria)(1.29%、3.51%和0.57%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(1.22%、2.70%和3.27%)、廣古菌門(Euryarchaeota)(0.73%、0.15%和1.70%)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)(0.13%、0.16%和0.01%)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)(0.16%、0.30%和0.01%)和酸桿菌門(Acidobacteria)(0.02%、0.07%和0.00%)。不同時間點間放牧蒙古牛腸道微生物群落組成具有差異，隨著天氣逐漸變冷，厚壁菌門豐度減少，而擬桿菌門豐度增多。天氣最冷的次年1月時放牧蒙古牛腸道中藍(lán)藻菌門、纖維桿菌門及酸桿菌門幾乎沒有被發(fā)現(xiàn)。

左側(cè)是UPGMA聚類樹結(jié)構(gòu)，右側(cè)的是各樣本在門水平上的物種相對豐度分布圖。UPGMA cluster tree structure is on the left,and the relative abundance distribution of each sample at the phylum level is on the right.Firmicutes:厚壁菌門；Bacteroidetes:擬桿菌門；Actinobacteria:放線菌門；Proteobacteria:變形菌門；Verrucomicrobia:疣微菌門；Euryarchaeota:廣古菌門；Cyanobacteria:藍(lán)藻菌門；Fibrobacteres:纖維桿菌門；Acidobacteria:酸桿菌門；Melainabacteria;Others:其他圖3 不同時間點放牧蒙古牛腸道微生物結(jié)構(gòu)的基于加權(quán)Unifrac距離的UPGMA聚類樹Fig.3 Based on weighted Unifrac distance of UPGMA cluster tree of gut microbial structure of grazing Mongolian cattle among different time points

表4 門水平上蒙古牛糞便菌群豐度Table 4 Abundance of fecal microbiota for Mongolian cattle at phylum level %

2.5 不同時間點蒙古牛腸道菌群種分類水平下的結(jié)構(gòu)

在屬水平上，由于屬的種類多且部分屬的相對豐度較低，因而僅對排名前10的屬進(jìn)行了分析。由表5可知，不同組間放牧蒙古牛腸道菌群在屬水平上的優(yōu)勢物種為擬桿菌屬(Bacteroides)、艾克曼菌屬(Akkermansia)，其11、12月和次年1月擬桿菌屬的豐度分別為5.84%、8.06%、6.32%；艾克曼菌屬的豐度分別為1.22%、2.69%、3.26%。其次分別為未明確棒狀桿菌科相關(guān)菌屬(Unidentified_Corynebacteriaceae)(0.00%、0.61%和0.00%)、Romboutsia(2.27%、0.45%和4.29%)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)(0.52%、0.05%和1.54%)、別樣桿菌屬(Alistipes)(3.07%、3.69%和1.78%)、未明確梭菌目相關(guān)菌屬(Unidentified_Clostridiales)(0.60%、0.88%和0.59%)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)(0.00%、0.17%和0.00%)、未明確藍(lán)藻菌相關(guān)菌屬(Unidentified_Cyanobacteria) (0.13%、0.16%和0.01%)、未明確瘤胃球菌科相關(guān)菌屬(Unidentified_Ruminococcaceae)(1.72%、1.01%和0.98%)。寒冷的次年1月時蒙古牛腸道中艾克曼菌屬、Romboutsia和甲烷短桿菌屬的相對豐度高于其他時間點。

表5 屬水平上蒙古牛糞便菌群豐度Table 5 Abundance of fecal microbiota for Mongolian cattle at genus level %

2.6 不同時間點蒙古牛腸道菌群物種LEfSe分析

組間物種差異分析能夠判別出不同時間點的整體群落結(jié)構(gòu)是否有顯著性的不同。為了找出不同時間點具有顯著差異的物種，可通過LEfSe分析尋找標(biāo)記性質(zhì)的物種(Biomarker)。LDA柱形圖長度越長代表差異物種對組間差異性的影響越大。本研究利用LEfSe分析不同時間點的差異物種并通過線性判別分析評估差異物種的影響大小，最后繪制差異物種的線性判別分析值分布柱狀圖，可以清楚的展示出不同時間點各自的優(yōu)勢物種。線性判別分析值>4的標(biāo)記性質(zhì)的物種共有14個。次年1月時最多，有6個重要的微生物類群，包括理研菌科(Rikenellaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和Romboustia屬，其中理研菌科的影響最大。而12月時最少，只有3個標(biāo)記性質(zhì)的物種,變形菌門、擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌屬(Bacteroides)(圖4)。

2.7 PICRUSt功能預(yù)測

PICRUSt可以根據(jù)16S rRNA 測序數(shù)據(jù)對樣品中的微生物功能類別相對豐度進(jìn)行基于KEGG數(shù)據(jù)庫的功能預(yù)測。用PICRUSt對冬季放牧蒙古牛腸道微生物進(jìn)行了功能預(yù)測。由圖5可以看出，KEGG通路二級功能層面上豐度排名前35的預(yù)測功能基因及它們在每個組中的豐度信息。寒冷的1月時有18個功能基因通路的豐度增加，有15個功能基因豐度降低。豐度增加的通路包括糖的生物合成和代謝、運輸和分解代謝、信號分子和相互作用、核苷酸代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、新陳代謝、碳水化合物代謝、輔因子和維生素的代謝、能量代謝和氨基酸代謝等相關(guān)通路。然而，豐度增加的這些功能基因通路在11和12月時豐度降低。豐度降低的功能基因通路有免疫系統(tǒng)、細(xì)胞運動性、環(huán)境適應(yīng)性、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)、膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞生長與凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥、遺傳信息處理、細(xì)胞過程和信號和脂代謝通路。結(jié)果表明，隨著天氣逐漸變冷，免疫系統(tǒng)、環(huán)境適應(yīng)性及細(xì)胞運動性相關(guān)通路豐度降低，氨基酸代謝通路豐度增加。

3 討 論

隨著國內(nèi)外研究者對腸道微生物學(xué)研究的不斷深入，諸多研究表明腸道微生物在營養(yǎng)預(yù)處理和能量獲取方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24-25]。蒙古牛常年自然放牧，生理生態(tài)受外界影響甚少，其腸道微生物群落和組成保持原始狀態(tài)。作為草食性反芻動物,其胃腸道需要對牧草中的纖維、淀粉和糖進(jìn)行吸收利用,而反芻動物胃腸道本身并不能產(chǎn)生必需的纖維降解酶,這種酶必須由與宿主共生的腸道細(xì)菌產(chǎn)生,因此研究食物短缺的冬季放牧蒙古牛腸道微生物多樣性具有重要意義。然而關(guān)于放牧蒙古牛腸道微生物受季節(jié)變化影響的研究尚未報道。

LDA值分布柱狀圖評判細(xì)菌分類在不同時間點的顯著差異；縱坐標(biāo)為不同時間點間具有顯著差異的分類單元；橫坐標(biāo)為對應(yīng)分類單元的LDA差異分析對數(shù)得分值；柱狀的長度代表LDA得分。The histogram of LDA value distribution is used to evaluate the significant difference of bacterial classification at different time points.The ordinate is the taxon with significant difference among different time points.The abscissa is the logarithmic score value of LDA difference analysis of corresponding taxon.f_Ruminococcaceae:瘤胃球菌科;c_Clostridia:梭菌綱；o_Clostridiales：梭菌目；p_Firmicutes:厚壁菌門；f_Christensenellaceae:克里滕森氏菌科；f_Rikenellaceae:理研菌科；f_Peptostreptococcaceae:消化鏈球菌科；o_Bacteroidetes:擬桿菌目；p_Bacteroidetes:擬桿菌門；c_Bacteroidia:擬桿菌綱；g_Romboustia:Rombostia屬；p_Proteobacteria:變形菌門；f_Bacteroidaceae:擬桿菌科；g_Bacteroides:擬桿菌屬。圖4 不同時間點放牧蒙古牛糞便微生物群落LEfSe多級物種差異LDA判別分析Fig.4 LDA discriminant analysis of LEFSe multi-level species diversity of fecal microbial community in grazing Mongolian cattle among different time points

越偏紅表示相對豐度越高；越偏藍(lán)色表示相對豐度越低。More red indicates higher relative abundance;while more blue indicates lower relative abundance.圖5 PICRUSt基因預(yù)測聚類熱圖Fig.5 Heatmap of PICRUSt gene predicted function

周應(yīng)敏等[26]利用高通量測序技術(shù)研究亞成體大熊貓腸道菌群多樣性的季節(jié)性差異發(fā)現(xiàn)，冬季大熊貓腸道微生物結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，微生物豐度也相對較高，冬季細(xì)菌的優(yōu)勢度明顯高于其他季節(jié)。Oakley等[27]利用16S rRNA基因擴(kuò)增子測序?qū)θ怆u盲腸菌群進(jìn)行了鑒定發(fā)現(xiàn)冬季肉雞盲腸細(xì)菌屬明顯少于春季或夏季。Liu等[28]研究發(fā)現(xiàn)在相同的飼養(yǎng)條件和生活環(huán)境下，冬季組與夏季組相比，同一品系大鼠空腸和回腸厚壁菌門的相對豐度顯著降低，而空腸、回腸和結(jié)腸的變形桿菌門的相對豐度顯著增加。這些研究表明季節(jié)的變化影響宿主腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)。在本研究中，11和12月時放牧蒙古牛腸道菌群多樣性相似，而與次年1月時相比差異明顯。

食物資源對動物的生存和繁殖至關(guān)重要，動物面臨食物資源的可利用率和季節(jié)性變化以及寒冷冬季帶來的食物短缺和能量消耗增加的壓力[29]。處于季節(jié)性動態(tài)變化環(huán)境中的動物，其食物的質(zhì)量也會隨之而變化，動物需要調(diào)節(jié)自身適應(yīng)這種食物資源變化帶來的挑戰(zhàn)。因此，了解放牧蒙古牛冬季如何解決這些生存挑戰(zhàn)，更有利于加深對物種的適應(yīng)性進(jìn)化的理解。假設(shè)季節(jié)性的食物變化可以改變蒙古牛腸道微生物多樣性。通過α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，11月到次年1月，蒙古牛腸道微生物豐富度及多樣性均呈明顯下降的趨勢，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(Shannon)。從PCoA和UPGMA分析來看，次年1月與其他月份的菌群種類明顯分開，而11和12月的菌群種類相似。淡瑞芳等[16]研究放牧地冬春季、夏季和秋季各牧場的牧草營養(yǎng)成分發(fā)現(xiàn)混合草樣營養(yǎng)成分隨季節(jié)變化而變化。張盼盼[30]研究表明，牧草中營養(yǎng)成分隨季節(jié)變化而變化，冬季牧草的營養(yǎng)價值最低，這與本研究結(jié)果相似。由于次年1月份時錫林郭勒盟屬于最寒冷的氣候，牧草營養(yǎng)成分及產(chǎn)量逐漸降低。這說明季節(jié)性食物的變化會影響宿主腸道微生物多樣性。

在本研究中，觀察到季節(jié)變化與腸道微生物的分類學(xué)組成有顯著關(guān)系。在門分類學(xué)水平上，冬季放牧蒙古牛腸道中厚壁菌門和擬桿菌門占主導(dǎo)地位，這與諸多草食性反芻動物的研究結(jié)果一致，如綿羊[31]、駱駝[32]和奶牛[33-34]等。厚壁菌門和擬桿菌門在許多哺乳動物的腸道微生物群落中廣泛分布，表明它們在消化道中的生態(tài)和功能意義[35-36]。胃腸道促進(jìn)纖維分解的主要細(xì)菌是厚壁菌門，它能夠?qū)⒗w維降解為反芻動物可利用的短鏈脂肪酸共宿主使用，而擬桿菌門主要降解碳水化合物，促進(jìn)胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育[37]。在本研究中，隨著天氣變冷，牧草質(zhì)量降低，食物短缺，蒙古牛處于瘦弱狀態(tài)，放牧蒙古牛腸道中厚壁菌門豐度減少，而擬桿菌門豐度增多。這與Ley等[38]研究的比較肥胖者和瘦者的腸道微生物組成相似，與瘦者個體相比較，肥胖者腸道中擬桿菌門的相對豐度有所減少，而厚壁菌門增多。現(xiàn)有的文獻(xiàn)表明，腸道中變形菌門是鑒定哺乳動物腸道健康的關(guān)鍵標(biāo)志，與腸道健康狀態(tài)成反比，其數(shù)量越少越健康[39]。次年1月時蒙古牛腸道中變形菌門含量最低。說明即使寒冷的季節(jié)，蒙古牛腸道微生態(tài)系統(tǒng)處于健康狀態(tài)。

在蒙古牛的腸道中發(fā)現(xiàn)了新抗癌明星細(xì)菌屬—艾克曼菌屬。有研究表明，該細(xì)菌通過競爭作用保護(hù)腸道免受病原體的侵害[40]。若腸道內(nèi)該細(xì)菌的豐度越多，動物就不會有肥胖和炎癥性疾病。除了抑制肥胖之外，還可以促進(jìn)腸道屏障功能。即使在腸道中沒有營養(yǎng)物質(zhì)，它也可以蓬勃的繁衍生息，發(fā)揮著益生菌的作用[41]。在本研究中，隨著天氣逐漸變冷，蒙古牛腸道中艾克曼菌屬豐度增加，說明蒙古牛腸道微生態(tài)系統(tǒng)越健康。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Romboutsia是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌屬[42]，通常在人體腸道中被鑒定，在維持宿主健康中扮演著重要的角色[43]。在本研究中，該菌屬在1月時最多。表明在食物短缺的季節(jié)，蒙古牛腸道中具有保護(hù)腸道且與健康狀況有關(guān)的細(xì)菌，有利于維持其腸道生態(tài)平衡。

腸道中微生物對免疫功能、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、甚至酶的代謝作用等有一定的影響[44]。腸道微生物對機(jī)體的生理功能有一定的影響。PICRUSt軟件預(yù)測微生物16S rRNA文庫，對其功能基因和類群進(jìn)行了探索，進(jìn)而將菌群結(jié)構(gòu)與宿主代謝相聯(lián)系。研究表明，PICRUSt軟件對腸道菌群功能基因預(yù)測的準(zhǔn)確度為85%～90%[45]。通過與數(shù)據(jù)庫比對搜索，腸道細(xì)菌編碼的大多數(shù)基因與代謝相關(guān)。PICRUSt功能預(yù)測結(jié)果表明，寒冷的次年1月碳水化合物代謝、能量代謝和氨基酸代謝等18個功能基因通路的豐度增加；免疫系統(tǒng)、細(xì)胞運動性和脂代謝通路等15個功能基因豐度降低。說明放牧蒙古牛腸微生物與分子、糖的生成和代謝等基礎(chǔ)生命功能有關(guān)。PICRUSt基因預(yù)測聚類熱圖顯示，相同功能在各月份間熱圖顏色有變化，說明各月份樣品雖然都具有相同的功能，但是由于每個月份的樣品中所含微生物的種類和數(shù)量有區(qū)別，所以各月份的效能存在差異。

4 結(jié) 論

利用基于腸道微生物16S rRNA基因測序技術(shù)，探索了自然放牧條件下冬季放牧蒙古牛腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)變化。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著天氣變冷，蒙古牛腸道微生物多樣性和豐度均下降，群落組成與結(jié)構(gòu)也有相應(yīng)的變化，可體現(xiàn)出微生物在不同時間點所表現(xiàn)出的消化與吸收功能的差異性。季節(jié)性食物的變化會影響宿主腸道微生物多樣性。強(qiáng)調(diào)了腸道微生物在放牧蒙古牛營養(yǎng)生態(tài)學(xué)中的重要作用，為了解蒙古牛腸道微生物群的季節(jié)動態(tài)關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。