阿娜爾 白東義 納日嘎 芒 來

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

精液冷凍技術(shù)是使優(yōu)秀種公馬的遺傳材料得以保存和使用的方法[1]。冷凍處理程序及種公馬的個(gè)體差異等因素對(duì)精液造成凍融損傷，使精液受胎率低于新鮮精液和冷藏精液[2]。因此，在生產(chǎn)上用于人工授精時(shí)，多數(shù)采用新鮮精液和冷藏精液，冷凍精液尚不能滿足生產(chǎn)需要。在我國(guó)，對(duì)馬冷凍精液的研究還處于試驗(yàn)階段。因此，進(jìn)一步優(yōu)化馬精液冷凍保護(hù)液是一項(xiàng)必須攻克的課題。

馬精液冷凍保存的程序與其他物種不同，其程序會(huì)從精液中清除大部分精漿，會(huì)降低抗氧化酶含量，破壞抗氧化酶系統(tǒng)的原有平衡，導(dǎo)致細(xì)胞膜和頂體的過氧化損傷[3]。因此，常通過添加相應(yīng)的抗氧化劑保護(hù)精子質(zhì)量[4]。谷胱甘肽和海藻糖是多個(gè)物種的精液冷凍保存中常用的抗氧化劑[5]。Joaquín等[6]發(fā)現(xiàn)，在豬精液解凍液中添加還原型谷胱甘肽可顯著提高精子受胎率，且具有劑量依賴性。海藻糖是非酶類活性氧清除劑，通過滲透作用和與精子質(zhì)膜中磷脂的特異性相互作用誘導(dǎo)其對(duì)氧化應(yīng)激起保護(hù)作用，其對(duì)冷凍保存精子質(zhì)量的有益作用已在公羊[7]、牛[8]、水牛[9]、小鼠[10]等物種中均得到報(bào)道。目前，馬精液冷凍保存領(lǐng)域中有較多的有關(guān)單獨(dú)添加不同劑量谷胱甘肽或海藻糖的相關(guān)研究，其適宜添加量因不同品種不同基礎(chǔ)液而異[21,25]。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合添加0.9 g/L維生素C和2.5 mmol/L谷胱甘肽顯著提高了公驢凍融后精液質(zhì)量[11]；100 mmol/L 海藻糖結(jié)合2 mmol/L維生素E顯著提高了公羊凍融后精液質(zhì)量[12]，但聯(lián)合添加相關(guān)抗氧化劑的穩(wěn)定性及其作用機(jī)理尚不明確?？寡趸富钚缘南嚓P(guān)研究已在水牛[13]、羊[14]、豬[15]、馬[3]及人[16]精液已有報(bào)道，而這些研究主要側(cè)重于其產(chǎn)生機(jī)理、不同個(gè)體之間的差異及其與精液品質(zhì)的關(guān)系，但對(duì)抗氧化劑是否通過影響酶活性而影響精子質(zhì)量尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究分析了不同抗氧化劑組合對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果和抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討抗氧化劑對(duì)蒙古馬精液冷凍保存作用，并是否通過酶活性而影響精子質(zhì)量，以期進(jìn)一步優(yōu)化馬精子冷凍保護(hù)液，提高精子冷凍效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

種公馬來自內(nèi)蒙古自治區(qū)二連浩特市策格馬場(chǎng)，品種為蒙古馬。用于研究的精液樣品是從每隔一天進(jìn)行常規(guī)采集的精液中獲得的等份試樣，常規(guī)采集的精液用途為商業(yè)化的人工授精項(xiàng)目。采精季節(jié)均在馬匹繁殖季節(jié)，于每年5—7月進(jìn)行，試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行了2年。采精期間，加強(qiáng)公馬飼養(yǎng)管理。

隨機(jī)選取體格健壯，繁殖性能良好，年齡4～15歲(平均9歲)的種公馬10匹。每個(gè)試驗(yàn)階段選取其中3～4匹。精液活力達(dá)鮮精質(zhì)量要求才用于后續(xù)試驗(yàn)。在收集用于試驗(yàn)的精液之前，預(yù)采精2周以達(dá)到穩(wěn)定的質(zhì)量。

1.2 主要試劑

葡萄糖、乳糖、棉子糖、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、海藻糖、還原型谷胱甘肽均購(gòu)自Sigma公司。MDA、CAT、SOD、GSH-PX、GR試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 馬冷凍精液的制作

1.3.1冷凍保護(hù)液的制備

INRA82基礎(chǔ)液的配制：選取2.5 g葡萄糖、0.15 g乳糖、0.15 g棉子糖、0.025 g檸檬酸鈉、0.041 g檸檬酸鉀、0.476 g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.05 g青霉素、0.05 g慶大霉素，放入無菌容器中，加入雙蒸水溶解，定容至100 mL，室溫下用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0 min。

卵黃液的獲得：取新鮮雞蛋，去除蛋清后，把卵黃膜刺透，卵黃液收集到用冰冷卻的容器中。

脫脂奶的配制：按照脫脂奶粉說明書，取脫脂奶粉10.0 g放入無菌容器中，加入雙蒸水溶解，定容至100 mL，室溫下用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0～20 min，獲得10%脫脂奶。

INRA82稀釋液構(gòu)成：基礎(chǔ)液50 mL+脫脂奶50 mL+2%卵黃液；將配制好的稀釋液放置37 ℃水浴鍋中，放置時(shí)間不得超過2 h。

INRA82冷凍保護(hù)液構(gòu)成：基礎(chǔ)液50 mL+脫脂奶50 mL+2.0%卵黃液+2.5%甘油。INRA82的pH為6.8～7.0，滲透壓為300～330 mOsm/kg。冷凍保護(hù)液置于室溫中，放置時(shí)間不得超過2 h。

1.3.2精液的采集

采精之前，應(yīng)用溫水清洗干凈公馬陰莖。用INRA假陰道(法國(guó)卡蘇)采集精液。選取性情溫順的發(fā)情母馬做臺(tái)馬。新鮮精液去除膠狀物，再用Φ240 mm的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾后進(jìn)行密度測(cè)定(ACUCELL密度儀)，取10 μL原精在電子顯微鏡下鏡檢活力(200倍),色澤乳白色，精子活力≥60%，精子密度≥1.0×109個(gè)/mL的正常精液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3精液的處理

3～4匹馬精液中獲得等份試樣進(jìn)行混合，用INRA82稀釋液進(jìn)行1∶1稀釋，緩慢操作并輕輕搖均，隨后在室溫條件下離心(600 g)10 min，棄去上清液，再用INRA82冷凍保護(hù)液稀釋至100×106個(gè)/mL，室溫保存?zhèn)溆?。稀釋后精液密度用血?xì)胞計(jì)數(shù)板來測(cè)定。

1.3.4精液的冷凍及解凍

用冷凍保護(hù)液稀釋精液，使精子密度達(dá)到100×106個(gè)/mL，然后將其灌裝至容積為0.5 mL的細(xì)管中，降溫直到4 ℃，平衡100 min后在離液氮面3 cm的地方熏蒸15 min，投入液氮中保存。放入液氮中的樣品至少保存1天。每組樣品解凍3支細(xì)管，解凍溫度和時(shí)間分別為37 ℃和30 s，在解凍后15 min內(nèi)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

冷凍保護(hù)液分為5個(gè)處理組，除了未添加組，其余組分別添加不同劑量的谷胱甘肽和海藻糖(表1)比較冷凍-解凍后TM、PM、AI、MI 4種精子質(zhì)量指標(biāo)，以明確谷胱甘肽和海藻糖最佳添加量；2)通過上述試驗(yàn)分別選取兩組最佳添加量，交叉聯(lián)合添加谷胱甘肽和海藻糖，同時(shí)測(cè)定MDA含量和SOD、CAT、GSH-PX、GR 4種抗氧化酶活性，以觀察谷胱甘肽和海藻糖聯(lián)合添加對(duì)蒙古馬精液冷凍保存的效果及協(xié)同效應(yīng)。

1.5 精子質(zhì)量評(píng)價(jià)

試驗(yàn)期間，10匹公馬隨機(jī)選取3～4匹采集精液混勻，經(jīng)過不同稀釋液冷凍-解凍后檢測(cè)精液常規(guī)品質(zhì)及抗氧化相關(guān)指標(biāo)。

1.5.1精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)檢測(cè)

精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀(CEROSS II，法國(guó)卡蘇公司)檢測(cè)。將冷凍-解凍后精液吹打混勻后取10 μL精液用90 μL PBS進(jìn)行稀釋，將2 μL添加到Leja 20 mm四腔載玻片(法國(guó)卡蘇公司)腔中，在37 ℃條件下檢測(cè)運(yùn)動(dòng)參數(shù)TM(運(yùn)動(dòng)精子比例)、PM(前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比例)。即在檢測(cè)腔室中隨機(jī)取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野至少觀測(cè)300個(gè)精子，并對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行分析，每支精液重復(fù)檢驗(yàn)3次。

1.5.2精液質(zhì)膜完整性檢測(cè)

MI采用SYBR14/PI熒光染色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，詳細(xì)步驟為：按1∶1比例用PBS稀釋精液，室溫離心(600 g)7 min。除去上清液，在其中注入HEPES緩沖液1 mL和SYBR14液5 μL，36 ℃孵育10 min，離心(600 g)7 min，棄上清，注入PBS液1 mL進(jìn)行稀釋，滴片，熒光顯微鏡(400倍)觀察。每個(gè)試驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子不少于200個(gè)，計(jì)算MI。

1.5.3精子頂體完整性檢測(cè)

用FITC-PNA熒光染料對(duì)AI進(jìn)行染色檢測(cè)。當(dāng)出現(xiàn)綠色熒光時(shí)說明精子頂體出現(xiàn)破損。將精液解凍之后使用PBS按照1∶1的比例進(jìn)行稀釋，離心(650 g，7 min，室溫)，在離心結(jié)束之后除去上清液，注入1 mL的PBS清洗1次。注入20 μL的FITC-PNA溶液，放到溫度為36 ℃的溫度下孵育10 min，將其滴片放到熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)組別解凍3支試管，每支試管選取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本中精子的數(shù)量不能低于200個(gè)。計(jì)算AI。

1.5.4抗氧化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

對(duì)冷凍-解凍后精液，MDA含量、CAT、SOD、GSH-PX和GR活性嚴(yán)格按照試劑盒說明測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異采用單因素方差分析，使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean±SD)表示，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著，P>0.05差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對(duì)冷凍-解凍后馬精子質(zhì)量的影響

2.1.1不同劑量谷胱甘肽對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果的影響

由表2可以看出，添加5.0 mg/mL的谷胱甘肽組PM顯著高于其他組(P<0.05)，TM和MI均高于其他組，但差異不顯著(P>0.05)；添加7.0 mg/mL的AI顯著高于其他組(P<0.05)。

表2 不同劑量的谷胱甘肽對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果的影響Table 2 Effects of different doses of glutathione on the quality of frozen-thawed Mongolian stallion spermatozoa %

2.1.2不同劑量海藻糖對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果的影響

由表3可以看出，添加50 mg/mL海藻糖組TM、PM和MI均顯著高于其他組(P<0.05)；不同劑量海藻糖組內(nèi)AI未見顯著差異(P>0.05)。

表3 不同劑量海藻糖對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果的影響Table 3 Effects of different doses of trehalose on the quality of frozen/thawed Mongolian stallion spermatozoa %

2.1.3不同組合谷胱甘肽+海藻糖對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果的影響

由表4可以看出，聯(lián)合添加5.0 mg/mL谷胱甘肽+35.0 mg/mL海藻糖組冷凍-解凍后精子TM、PM、AI和MI均顯著高于其他聯(lián)合組(P<0.05)，表明聯(lián)合添加5.0 mg/mL谷胱甘肽+35.0 mg/mL海藻糖可明顯提高精子活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、質(zhì)膜完整率、頂體完整率，冷凍效果最好。

表4 不同組合谷胱甘肽+海藻糖對(duì)蒙古馬精液冷凍保存效果的影響Table 4 Effects of the combination of glutathione and trehalose on the quality of frozen-thawed Mongolian stallion spermatozoa %

2.2 不同抗氧化劑對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

2.2.1不同劑量谷胱甘肽對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

谷胱甘肽對(duì)精液中MDA含量及4種抗氧化酶活性的影響如表5所示。由表5可見，與其他劑量組相比，5.0 mg/mL的谷胱甘肽可降低精液中MDA含量；添加4種劑量的谷胱甘肽均可顯著提高精液中CAT活性(P<0.05)；5.0 和7.0 mg/mL添加組GSH-PX活性均顯著高于其他組(P<0.05)；5.0 mg/mL 劑量的GR活性顯著高于其他組(P<0.05)。

表5 不同劑量谷胱甘肽對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響Table 5 Effects of different doses of glutathione on antioxidase activity in Mongolian stallion semen

2.2.2不同劑量海藻糖對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

海藻糖對(duì)精液中MDA含量及4種抗氧化酶活性的影響如表6所示。由表6可見，海藻糖劑量為35.0 mg/mL時(shí)，精液中MDA含量顯著低于其他組(P<0.05)；不同劑量的海藻糖均可顯著提高SOD活性(P<0.05)。

表6 不同劑量海藻糖對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響Table 6 Effects of different doses of trehalose on antioxidase activity in Mongolian stallion semen

2.2.3不同組合谷胱甘肽+海藻糖對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

不同組合谷胱甘肽+海藻糖對(duì)精液中MDA及4種抗氧化酶活性的影響如表7所示。由表7可知，聯(lián)合添加量為(5.0+35.0)mg/mL時(shí)，精液中MDA含量顯著低于其他組(P<0.05)，GSH-PX活性顯著高于其他組(P<0.05)；添加組SOD活性均顯著高于其他組(P<0.05)；CAT、GR的活性組內(nèi)未見差異(P>0.05)。結(jié)果表明，聯(lián)合添加 5.0 mg/mL谷胱甘肽+35.0 mg/mL海藻糖可顯著降低精液MDA含量，提高GSH-PX和SOD活性，避免其遭受過氧化損害，能夠在一定程度上提高馬冷凍-解凍后精液質(zhì)量。

表7 不同組合谷胱甘肽+海藻糖對(duì)蒙古馬精液中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響Table 7 Effects of the combination of glutathione and trehalose on antioxidase activity in Mongolian stallion semen

3 討 論

馬精子擁有防御活性氧的主要酶系，當(dāng)精液經(jīng)過離心去除精清導(dǎo)致抗氧化酶濃度降低，整個(gè)酶系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)就失去平衡，清除活性氧效率下降，導(dǎo)致精液質(zhì)量下降[17]。在冷凍保護(hù)液中，加入抗氧化劑能夠在一定程度上提高冷凍-解凍后的精液質(zhì)量，同時(shí)能夠提升受精能力[3]。SOD主要來源于精清，CAT是精液中最重要的抗氧化酶，而還原型谷胱甘肽參與體內(nèi)GSH-PX酶促反應(yīng)，有效促進(jìn)GSH-PX清除活性氧，同時(shí)，作為輔助因子與SOD和CAT相互作用，抑制活性氧產(chǎn)生[4]。海藻糖通過改善抗氧化酶活性而降低了精子的脂質(zhì)過氧化[18]。Ball等[19]研究發(fā)現(xiàn)，活性氧的增多導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低馬解凍后精子活力，使馬精子質(zhì)量顯著下降。Rodrigo等[20]將2.5 mmol/L(0.77 mg/mL)還原型谷胱甘肽添加到種公馬冷凍保護(hù)液中，改善了精液的TM、PM和MI。Mahdi等[21]將5 mmol/L(1.54 mg/mL)還原型谷胱甘肽添加到種公馬稀釋液中，改善了精液的TM、PM和MI，降低了MDA含量。Hu等[22]在牛精液中添加的還原型谷胱甘肽組與未添加組相比，MDA含量顯著降低，SOD和GSH-PX活性顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，5.0 mg/mL谷胱甘肽對(duì)精子TM、PM和MI均有提高，可降低精液中MDA含量，添加谷胱甘肽可顯著提高CAT和GSH-PX活性，說明添加5.0 mg/mL谷胱甘肽對(duì)蒙古馬精液品質(zhì)有改善作用，酶活性的改變可能是由于抗氧化劑參與了酶促反應(yīng)，提高了精液活性氧清除系統(tǒng)的能力，從而保持精液凍融后的酶系統(tǒng)穩(wěn)定性，并一定程度上保持了精液質(zhì)量。然而，Baumber等[23]將10 mmol/L(3.07 mg/mL)谷胱甘肽添加到馬精液后均未改善其TM和PM。其原因可能是不同精液冷凍程序、不同馬品種精液對(duì)不同劑量的差異性。

Diya等[24]添加34.2 mg/mL海藻糖提高了馬冷凍精液TM、AI和MI。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著海藻糖的劑量增加，精液各項(xiàng)指標(biāo)均得到了改善，35.0和 50.0 mg/mL 海藻糖可提高TM、PM、AI和MI，且35.0 mg/mL海藻糖可顯著降低MDA含量。綜合考慮精液質(zhì)量和抗氧化相關(guān)指標(biāo)的變化，35.0 mg/mL 劑量的海藻糖可能提高了酶促系統(tǒng)的防御能力，其精液質(zhì)量也得到了相應(yīng)的改善。而Arifiantini等[25]添加的50 mmol/L(17.1 mg/mL)海藻糖對(duì)冷藏狀態(tài)下的馬精子質(zhì)量沒有產(chǎn)生有益的影響。其原因可能是在冷藏環(huán)境下，未產(chǎn)生大量的死精子及其活性氧產(chǎn)物，精液抗氧化酶系統(tǒng)自身能夠應(yīng)對(duì)低溫應(yīng)激，因此，海藻糖未能夠發(fā)揮明顯的保護(hù)作用。

添加單一的抗氧化劑可能不足以提高精液的冷凍保存質(zhì)量[26-27]。近年來，聯(lián)合添加抗氧化劑的組合已成功用于人類[28]、公牛[29]和公豬[15]精子的冷凍保護(hù)液中。這些聯(lián)合添加的組合對(duì)精子的保護(hù)作用與脂質(zhì)過氧化物的減少以及抗氧化劑在清除冷凍保存過程中產(chǎn)生的活性氧的協(xié)同作用相關(guān)。基于單獨(dú)添加不同劑量抗氧化劑的精子各項(xiàng)指標(biāo)基礎(chǔ)上，本研究分別選取兩組最佳添加量，交叉聯(lián)合添加谷胱甘肽和海藻糖，結(jié)果顯示，聯(lián)合添加5.0 mg/mL谷胱甘肽+35.0 mg/mL海藻糖可顯著降低MDA含量，提高SOD和GSH-PX活性，可間接反映精子的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)受到減弱，其抗氧化能力增加，對(duì)精子的氧化應(yīng)激起到了保護(hù)作用。與此同時(shí)，其TM、PM、AI和MI均顯著高于其他聯(lián)合組，進(jìn)一步說明，比起單獨(dú)添加更能提高冷凍精液抗氧化應(yīng)激能力，從而能更好地發(fā)揮其冷凍保護(hù)能力。因此，通過測(cè)定酶活性進(jìn)一步探究抗氧化劑對(duì)酶系統(tǒng)的作用，對(duì)精液整個(gè)活性氧清除系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要參考意義，也是對(duì)進(jìn)一步研究常規(guī)抗氧化劑或?qū)ふ倚滦涂寡趸瘎┨峁┲匾罁?jù)。

本試驗(yàn)中使用的簡(jiǎn)單離心程序無法將精清全部清除，精液中可能殘留少量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可能影響精子質(zhì)量和抗氧化酶活性。因此，優(yōu)化精液離心程序或選取不受殘留精清影響的、更具有代表性的抗氧化劑對(duì)精液品質(zhì)和抗氧化相關(guān)指標(biāo)的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步探究，為精液冷凍保存技術(shù)提供更全面、更科學(xué)的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

在蒙古馬精液冷凍保護(hù)液中聯(lián)合添加5.0 mg/mL谷胱甘肽+35.0 mg/mL海藻糖可顯著降低MDA含量，提升SOD和GSH-PX活性，提高了蒙古馬精液冷凍-解凍后質(zhì)量,提示此種組合的抗氧化劑對(duì)精子的氧化應(yīng)激起到了保護(hù)作用,但其作用機(jī)理仍待進(jìn)一步研究完善。