高正松，王保成，徐松泉，李 歡

(南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南京 210042)

甘油二酯，亦稱甘二酯或二脂肪酸甘油酯，可由甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)中一個脂肪酸醇解為羥基所得，也可由兩分子脂肪酸與丙三醇(甘油)酯化后得到，英文名稱為diacylglycrol或diglyceride，簡寫為DAG或DG。按照?；w脂肪酸與甘油羥基的結(jié)合位置不同，甘油二酯可以分為兩種立體異構(gòu)體，其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其中R或R1是飽和或不飽和脂肪酸基。

圖1 甘油二酯的兩種結(jié)構(gòu)示意圖

屬于油脂天然成分的甘油二酯，含量通常小于甘油三酯的5%。日本營養(yǎng)學(xué)家Yasukawa[1]研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)代謝過程中，甘油二酯，特別是1,3-甘油二酯，其代謝特征不同于甘油三酯。1,3-甘油二酯獨(dú)特的代謝特征，使其在預(yù)防肥胖方面有著一定的作用。

圖2 甘油三酯體內(nèi)代謝途徑

體內(nèi)代謝過程中(圖2)，甘油三酯主要有兩條代謝途徑，分別為：(1)甘油三酯經(jīng)胰脂肪酶催化水解，生成1,3-甘油二酯，1,3-甘油二酯經(jīng)胰脂肪酶進(jìn)一步水解，生成1(3)-甘油單酯，1(3)-甘油單酯經(jīng)過β-氧化生成人體所需的能量；(2)甘油三酯經(jīng)胰脂肪酶催化水解生成1,2(2,3)-甘油二酯，1,2(2,3)-甘油二酯可經(jīng)胰脂肪酶水解生成2-甘油單酯，也可以與體內(nèi)的游離脂肪酸在?；D(zhuǎn)移酶的催化下，重新生成甘油三酯。2-甘油單酯會重新和游離脂肪酸被?；D(zhuǎn)移酶酯化為1,2(2,3)-甘油二酯，進(jìn)而被繼續(xù)酯化為甘油三酯。當(dāng)甘油三酯沒有被及時消耗轉(zhuǎn)化為能量，便會積蓄在人體內(nèi)，對人體健康造成危害[2-4]。1,3-甘油二酯的消化途徑則防止體內(nèi)脂肪累積[5-7]。因此食用含有1,3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪積累、防止體重增加的效果。

1,3-甘油二酯不同于甘油三酯的獨(dú)特代謝方式，使得其具有重要的潛在價值。1,3-甘油二酯不僅可以作為保健油脂，還可以作為醫(yī)藥輔料、化妝品輔料、藥物合成中間體等，市場廣闊，經(jīng)濟(jì)價值可觀。1,2-甘油二酯作為1,3-甘油二酯的同分異構(gòu)體，雖然代謝方式有別于1,3-甘油二酯，但是其作為食用油脂的重要成分，同樣被廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)中。

天然存在的甘油二酯很少，主要是通過油脂的產(chǎn)后修飾技術(shù)獲得。就方式而言，產(chǎn)后修飾可以由生物催化劑實現(xiàn)，也可由傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑完成。產(chǎn)后修飾技術(shù)所得的甘油二酯，在純度和選擇性上很難滿足現(xiàn)階段醫(yī)藥輔料、化妝品輔料和藥物合成中間體的需求，故研究者們將目光投向了合成法制備甘油二酯的領(lǐng)域。本文從不同的合成路線出發(fā)，介紹了幾種1,3-甘油二酯和1,2(2,3)-甘油二酯的合成方法，并對其后續(xù)的純化方法進(jìn)行了簡要闡述。

1 1,3-甘油二酯的合成

從制備機(jī)理看，1,3-甘油二酯的制備方法主要分為酶法與化學(xué)合成法兩種[8-11]。酶合成法的優(yōu)勢在于環(huán)境友好、無污染、耗能?。换瘜W(xué)合成法的優(yōu)勢在于利用特定的合成底物與催化劑，可定點(diǎn)催化合成高純度的1,3-甘油二酯。

1.1 酶法制備1,3-甘油二酯

酶法合成1,3-甘油二酯的方法主要包括甘油解法、酯交換法、直接酯化法[12]。

1.1.1 甘油解法制備1,3-甘油二酯

酶催化甘油解法是以甘油三酯和甘油為原料，在1,3-特異性脂肪酶的催化下制備1,3-甘油二酯的反應(yīng)(圖3)。Gotog等[13]以特異性脂肪酶Lipase 3A為催化劑，以菜籽油、大豆油和甘油為原料，成功制備了含量在40%以上的1,3-甘油二酯。Kahveci等[14]以甘油和菜籽油為原料，諾維信435為催化劑，制備了含量在40%～50%的1,3-甘油二酯。Valerio等[15]以同樣的酶為催化劑，以甘油和橄欖油為原料，在乳化體系下，最終得到了含量僅為17%的1,3-甘油二酯。Yamane等[16]以氫化牛油和甘油為原料，通過不斷析出固體的方法，在78 h后得到了含量為90%的1,3-甘油二酯產(chǎn)物。Liao等[17]將甘油和三油酸甘油酯以1：2的摩爾比混合，加入一定量溶劑后，在Lipozyme IM-77的催化作用下，反應(yīng)24 h后，制備得到了含量最大值為40%的1,3-甘油二酯。

甘油解法雖然工藝簡單，但耗時長，產(chǎn)物純度低，而且產(chǎn)品得率低，因此不適合用于生產(chǎn)1,3-甘油二酯。

圖3 甘油解法制備1,3-甘油二酯

1.1.2 酯交換法制備1,3-甘油二酯

酶催化酯交換法制備1,3-甘油二酯以甘油三酯和甘油單酯(或脂肪酸甲酯)為原料，在特異性脂肪酶的催化下，生成1,3-甘油二酯(圖4)。Weber等[18]以菜籽油和甘油單酯為原料，以脂肪酶Lipozyme RM IM為催化劑，成功制備了含量為75%的1,3-甘油二酯。杜偉等[19]在叔丁醇溶液中，以特異性酶催化了甘油單酯的酯交換反應(yīng)，通過對反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的探究，得到了含量大于75%的1,3-甘油二酯產(chǎn)物。李磊等[20]以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為反應(yīng)容器，以脂肪酶Lipozyme RM IM為催化劑，催化了米糠油和甘油單酯的酯交換反應(yīng)，最終得到了含量為27%的1,3-甘油二酯。Blasi等[21]以Novozyme 435為酯交換催化劑，通過一鍋兩步法制備了最終含量為60%的1,3-甘油二酯。

圖4 酯交換法制備1,3-甘油二酯

酯交換法制備1,3-甘油二酯的本質(zhì)為兩步反應(yīng)的復(fù)合反應(yīng)，第一步是甘油三酯的水解反應(yīng)，第二步是水解后的酯化反應(yīng)。在酯交換法制備1,3-甘油二酯的過程中，如何實現(xiàn)復(fù)合反應(yīng)中水解和酯化的平衡是難點(diǎn)，且酶催化酯交換法制備1,3-甘油二酯的原料成本較高，故不宜工業(yè)化生產(chǎn)。

1.1.3 酯化法制備1,3-甘油二酯

酶催化酯化法制備1,3-甘油二酯是以甘油和脂肪酸為原料，以特異性脂肪酶為催化劑，制備1,3-甘油二酯，在酯化過程中，會生成相應(yīng)的副產(chǎn)物甘油三酯、1,2-甘油二酯和甘油單酯等(圖5)。Rosu等[22]以甘油和乙酸為原料，以固定化脂肪酶為催化劑，在沒有溶劑的條件下，制備了1,3-二乙酸甘油酯。在反應(yīng)8 h以后，甘油二酯的含量可達(dá)84%。李湘等[23]以諾維信435為催化劑，調(diào)整油酸和甘油的比例為2.27：1，在真空除水的條件下反應(yīng)6 h，可以得到含量為70%的甘油二酯產(chǎn)物。Wang等[24]以磷脂酶A1為催化劑催化制備了1,3-甘油二酯的合成，在反應(yīng)4 h后，可獲得最終含量為43%的甘油二酯產(chǎn)物。Liu等[25]用同樣的磷脂酶A1為催化劑，催化了油酸和甘油的酯化反應(yīng)，通過調(diào)整油酸與甘油的比例為1：5，在4%催化劑含量下，40 ℃反應(yīng)1.5 h，可得純度為54%的1,3-甘油二酯。Duan等[26]和Watanabe等[27]利用特異性脂肪酶，均成功催化了1,3-甘油二酯的合成，Watanabe在真空條件下除去生成的水，反應(yīng)3 h后即得到了含量為70%的1,3-甘油二酯產(chǎn)物。

圖5 酯化法制備1,3-甘油二酯

Fig.5 Preparation of 1,3-diacylglycrol by esterification

直接酯化法具有反應(yīng)時間短、產(chǎn)物純度高、反應(yīng)步驟簡單等優(yōu)勢，對于制備高純度的1,3-甘油二酯具有重要的意義。

1.2 化學(xué)合成法制備1,3-甘油二酯

化合合成法制備1,3-甘油二酯的優(yōu)勢在于，當(dāng)反應(yīng)底物特定，在特定的催化劑催化下，可以高效制備高純度的1,3-甘油二酯。

2001年，Imanishi等[28]從1,3-二羥基丙酮出發(fā)，與脂肪酸在堿催化下合成1,3-二甘油酯丙酮，再通過硼氫化鈉對2位羰基進(jìn)行還原，最終得到1,3-甘油二酯(圖6)。

圖6 1,3-二羥基丙酮與脂肪酸反應(yīng)制備1,3-甘油二酯

2011年，Harbige等[29]同樣從1,3-二羥基丙酮出發(fā)，合成了用于治療神經(jīng)疾病藥物的重要中間體1,3-甘油二酯。

2014年，Sonoke等[30]以1,3-二羥基丙酮二聚體為原料，通過與醇縮合制得1,3-二甘油酯丙酮，再利用還原試劑將1,3-二甘油酯丙酮還原為1,3-甘油二酯(圖7)。這種先縮合再還原的方法可以高效制備1,3-甘油二酯。

圖7 1,3-二羥基丙酮二聚體為原料制備1,3-甘油二酯

2014年，Narine等[31]從丙酮縮甘油出發(fā)，與酰氯反應(yīng)首先制備兩端羥基被保護(hù)的甘油單酯，甘油單酯在酸性條件下脫保護(hù)，脫保護(hù)后的甘油單酯與另一摩爾當(dāng)量的酰氯反應(yīng)，制備1,3-甘油二酯(圖8)。該方法的優(yōu)勢在于可以制備1,3位不對稱的甘油二酯。當(dāng)R1與R2相同時，又可以制備高純度的對稱的1,3-甘油二酯。

圖8 丙酮縮甘油為原料制備1,3-甘油二酯

2 1,2-甘油二酯的合成

1,2-甘油二酯多以化學(xué)合成法制備，利用特定的底物和催化劑，可以高效制備高純度的1,2-甘油二酯。

1991年，Charles Mioskowski等[32]以丙酮縮甘油為原料，先利用3,4-二甲氧基芐基氯對羥基進(jìn)行保護(hù)，之后在酸性條件下將丙酮保護(hù)的羥基進(jìn)行脫保護(hù)，使1,2號位的羥基裸露。將3號位羥基被保護(hù)的甘油與脂肪酰氯反應(yīng)，制備3號位羥基保護(hù)的1,2-甘油二酯。再對3號位羥基進(jìn)行脫保護(hù)，得到目標(biāo)產(chǎn)物1,2-甘油二酯(圖9)。制備后的高純1,2-甘油二酯被成功地用于新型脂質(zhì)體的制備。

圖9 丙酮縮甘油為原料制備1,2-甘油二酯

2007年，Richard等[33]從縮水甘油出發(fā)，利用叔丁基二甲基氯硅烷對縮水甘油的羥基進(jìn)行保護(hù)，羥基保護(hù)后的縮水甘油在雅格博森催化劑的催化下與手性醋酸鈷反應(yīng)，得到手性的羥基被保護(hù)的甘油，被保護(hù)的甘油在DMAP催化下與油酸反應(yīng)，得到1,2號位的油酸酯產(chǎn)物，最后將保護(hù)羥基的叔丁基二甲基硅烷脫去，得到手性的1,2-二油酸甘油酯(圖10)。該法的優(yōu)勢在于可以得到手性的1,2-二油酸甘油酯，但是雅格博森催化劑難以買到，同時在縮水甘油開環(huán)的過程中產(chǎn)率較低，不適宜放大生產(chǎn)。

圖10 縮水甘油為原料制備1,2-甘油二酯

2016年，肖勇翔等[34]在發(fā)明專利《1,2-二酰甘油及其中間體的制備方法》中介紹到，先將丙酮縮甘油的羥基利用氯甲酸-9-芴基甲酯進(jìn)行保護(hù)，再在酸性條件下對保護(hù)后的丙酮縮甘油中丙酮保護(hù)的兩個羥基進(jìn)行脫保護(hù)，脫保護(hù)后的產(chǎn)物與脂肪酸進(jìn)行酯化，最后對酯化產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)即可得到1,2-甘油二酯。

圖11 以氯甲酸-9-芴基甲酯保護(hù)丙酮縮甘油制備1,2-甘油二酯

2017年，韓麗娟等[35]以3-氯甘油為原料，與醋酸鈉反應(yīng)生成3-醋酸甘油單酯，將3-醋酸甘油單酯在堿性催化劑催化下與脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)，制備1,2-二脂肪酰-3-醋酸甘油酯，最后將上述甘油三酯在甲醇溶液中與碳酸鉀進(jìn)行反應(yīng)，得到1,2-甘油二酯。該法制備1,2-甘油二酯的優(yōu)勢在于反應(yīng)步驟相對較短，利于放大生產(chǎn)。

圖11 3-氯甘油為原料制備1,2-甘油二酯

3 甘油二酯的純化方法

1,3-甘油二酯的制備過程中，會產(chǎn)生1,2-甘油二酯、甘油三酯、甘油單酯等副產(chǎn)物；在利用化學(xué)法制備1,2-甘油二酯的過程中，同樣會因為反應(yīng)的不完全而生產(chǎn)甘油單酯等副產(chǎn)物，所以需對制備后得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化分離，才可以得到高純度的甘油二酯。目前純化甘油酯的方法主要有以下四種：超臨界CO2萃取法、溶劑結(jié)晶分離法、分子蒸餾法和柱層析法[36]。

3.1 超臨界CO2萃取法

超臨界流體兼具氣、液、固三相的特性，不僅有著氣體的流動性優(yōu)勢，又兼具液體的溶解能力和低粘度特性，因此，超臨界流體可以作為優(yōu)異的萃取溶劑使用。CO2在超臨界狀態(tài)，可以依據(jù)待分離物質(zhì)的沸點(diǎn)高低、極性大小、溶解性的不同、對于熱敏感性的差異，達(dá)到高效分離物質(zhì)的目的。在甘油二酯的制備過程中，可以依據(jù)超臨界CO2獨(dú)特的萃取性能，將甘油二酯目標(biāo)產(chǎn)物與甘油單酯、甘油三酯等雜質(zhì)分離萃取出來，達(dá)到純化甘油二酯的目的。雖然超臨界CO2萃取法對于環(huán)境無污染、萃取效率高，但是使CO2處于超臨界狀態(tài)并用于萃取的成本太高，不適用于工業(yè)化放大生產(chǎn)。

3.2 重結(jié)晶分離法

重結(jié)晶分離法是依據(jù)待分離物質(zhì)在重結(jié)晶溶劑中的溶解度差異，從而實現(xiàn)依次從重結(jié)晶溶解中結(jié)晶析出達(dá)到分離的目的[37]。在甘油二酯的制備過程中，目標(biāo)產(chǎn)物甘油二酯與雜質(zhì)在特定溶劑中的溶解度不同，依舊這一特性，選擇合適的重結(jié)晶溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，達(dá)到分離純化甘油二酯的目的。重結(jié)晶方法雖然簡單，但選擇合適的重結(jié)晶溶解是個較大的難點(diǎn)。

3.3 分子蒸餾法

分子蒸餾是一種特殊的液-液分離技術(shù)。分子蒸餾技術(shù)依靠不同物質(zhì)在高真空下平均自由程的差別來進(jìn)行分離[38-40]。近年來，重結(jié)晶、柱層析等傳統(tǒng)分離技術(shù)所使用的大量溶劑，給分離物質(zhì)、環(huán)境帶來了污染，因此環(huán)境友好型的分子蒸餾工藝越來越受到科研工作者和醫(yī)藥化工企業(yè)的關(guān)注，在油脂產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，分子蒸餾技術(shù)也得到了廣泛的應(yīng)用[41-42]。鄒冬芽等[43]將分子蒸餾技術(shù)引入甘油二酯的分離純化中，得到了最終收率為77%的高純度甘油二酯。朱思啟等[44]在甘油單酯的分子蒸餾純化工藝中，通過改變蒸餾溫度、真空度、刮板轉(zhuǎn)速、進(jìn)料速率等因素，得到了最終含量為93%的最佳分子蒸餾工藝。王衛(wèi)飛等[45]在甘油二酯的分子蒸餾純化工藝中，通過對真空度、蒸餾溫度等條件的探索，得到了最優(yōu)的分子蒸餾工藝，在最佳工藝條件下，可以得到純度為98%的終產(chǎn)物。

分子蒸餾法具有受熱時間短、耗能低、產(chǎn)品色澤好、純度高等優(yōu)點(diǎn)，在1,3-甘油二酯的純化中可以用此方法分離反應(yīng)中產(chǎn)生的相應(yīng)副產(chǎn)物。

3.4 柱層析法

柱層析法，又稱為色譜柱法，是根據(jù)待分離物質(zhì)在固定相上的吸附能力不同而分離的方法。柱層析法需要選擇合適的固定相和流動相，利用流動相的洗脫，實現(xiàn)待分離物質(zhì)在固定相上的吸附→解吸→再吸附→再解吸過程，從而達(dá)到分離純化目的[46]。Maekawa等[47]將離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為洗脫劑對甘油單酯進(jìn)行洗脫分離，得到了最終純度為95%的甘油單酯產(chǎn)品。Zinnen等[48]用柱層析分離技術(shù)，實現(xiàn)了甘油單酯、甘油雙酯、甘油三酯的高效分離。

4 結(jié) 語

合成法制備甘油二酯的發(fā)展，彌補(bǔ)了天然甘油二酯在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的空缺。本文總結(jié)了1,3-甘油二酯的酶合成法、化學(xué)合成法以及1,2(2,3)-甘油二酯的化學(xué)合成法，并歸納了甘油二酯的純化手段，為后續(xù)甘油二酯的合成及純化提供了參考。