丁 源，陳 新，涂家生*，孫春萌**

（1中國藥科大學(xué)藥用輔料及仿創(chuàng)藥物研發(fā)評價中心，南京210009；2國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022）

蛋白及多肽類藥物通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)和作用位點，從而能夠在體內(nèi)發(fā)揮特異性的治療作用，與傳統(tǒng)藥物相比有更好的臨床有效性和安全性。然而，此類藥物大多存在穩(wěn)定性差、給藥劑量小、體內(nèi)半衰期短、生物利用度低等問題，尤其是治療慢性疾病的蛋白及多肽類藥物往往需要長期、頻繁注射，不僅順應(yīng)性低，還可能導(dǎo)致其他不良反應(yīng)的產(chǎn)生［1］。例如，采用貝伐珠單抗（bevacizumab）治療年齡相關(guān)性黃斑病變需要頻繁進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射，易于誘發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜出血和脫離等并發(fā)癥［2］。為延長蛋白及多肽藥物的體內(nèi)半衰期，研究人員通常采用融合長效化片段（與Fc 融合［3-4］、與人血清白蛋白融合［5］）、PEG 修飾、綴合脂肪酸鏈［6］、環(huán)化或氨基酸替代［7］等策略，并已有多款藥物成功上市。除對蛋白質(zhì)及多肽進(jìn)行分子改造外，還可通過制劑學(xué)手段改善蛋白及多肽類藥物的吸收并使其長效化，能夠有效縮短藥品研發(fā)周期、降低藥品研發(fā)成本。通過制劑學(xué)手段對蛋白及多肽類藥物進(jìn)行長效化改造的策略將被著重介紹，以期為促進(jìn)此類藥物的劑型改良提供研究思路。

Figure 1 Graphical tablet of major strategies for preparation of long-acting formulations containing proteins and peptides

1 注射劑

1.1 注射用微球

微球一般通過皮下或肌肉注射給藥，并隨著載體的緩慢溶蝕而持續(xù)釋放藥物。艾塞那肽是由美國FDA批準(zhǔn)的第1個胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑類多肽藥物，用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，其普通劑型（商品名Byetta?）需每天兩次進(jìn)行皮下注射；隨后，Amylin制藥公司以聚乳酸-羥基乙酸共聚物［Poly（D，L-lactic-co-glycolic acid），PLGA］為載體，成功開發(fā)了每周僅需注射1次的艾塞那肽緩釋微球（商品名Bydureon?），并于2011 年和2012 年先后獲得歐盟和美國FDA 批準(zhǔn)［8］。注射用微球的上市制劑還包括：注射用醋酸奧曲肽微球（商品名Sandostatin?LAR）、注射用帕瑞肽微球（商品名Signifor?LAR）、醋酸亮丙瑞林緩釋微球（商品名Lupron Deport?）等。

隨著PLGA 的廣泛應(yīng)用，研究人員已可以采用多種手段調(diào)控PLGA 微球釋放速率。首先，可在微球中加入致孔劑，主要包括無機(jī)鹽類（如NaHCO3、）、非離子表面活性劑類（如Poloxamer188、Tween20［11］）以及 其他 致孔 劑（如）。例如，以NaHCO3為致孔劑制備載有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1（neuregulin-1，Nrg-1）的PLGA 微球，可通過調(diào)節(jié)NaHCO3濃度實現(xiàn)不同的藥物釋放速率［9］。而對于非離子表面活性劑，其親水-疏水平衡（hydrophile-lipophile balance，HLB）值越高，藥物釋放越快，例如，以等量Poloxamer188（HLB 值29）、Tween20（HLB值16.7）或Span80（HLB值4.3）為致孔劑制備胰島素PLGA 微球，釋藥速率依次降低［11］。PLGA 微球的粒徑對藥物的釋放速率有多方面的影響［13］，隨著粒徑增大，PLGA 微球的自催化降解常數(shù)增大，將加速藥物釋放；但大尺寸也意味著總表面積減小、藥物擴(kuò)散路徑變長，將減緩藥物釋放，因此應(yīng)綜合考慮選擇最佳的微球粒徑。再者，PLGA 的性質(zhì)也影響藥物釋放，例如相對分子質(zhì)量更小［14］、丙交酯比例更低［15］的PLGA降解速度和釋藥速度更快；又例如親水的PLGA RG 502 H相比于疏水的PLGA RG 503，可以加速藥物釋放［10］。

然而，PLGA 微球常常會在給藥初期產(chǎn)生顯著的突釋現(xiàn)象，這可能是由于微球表面存在吸附藥物或藥物在微球中分布不均［16］。研究人員嘗試將聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和葡萄糖敏感的高分子材料p（AAPBA-co-NVCL）交替涂覆在胰島素PLGA 微球表面，不僅解決了突釋問題，還實現(xiàn)了葡萄糖濃度響應(yīng)性釋放［17］。

除PLGA，其他常見的緩釋微球用材料還包括聚乳酸（PLA）、殼聚糖（chitosan，CS）等。例如，采用PLA 制備的Lupron Deport?可用于治療晚期前列腺癌［18］。CS 具有正電性和組織黏附性，并且是一種天然免疫佐劑，因此用殼聚糖微球包載抗原肽［19］可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生長時間有效的免疫反應(yīng)。

1.2 緩釋脂質(zhì)體

在蛋白及多肽類藥物緩釋脂質(zhì)體的開發(fā)中，采用DepoFoam?技術(shù)制備的藥物遞送系統(tǒng)可用于腔內(nèi)注射（包括鞘內(nèi)、心室內(nèi)、玻璃體和硬膜外注射），并幫助藥物在近30 d 的時間內(nèi)緩慢釋放，這一技術(shù)促成了Depocyt?、DepoDur?及Exparel?等長效緩釋注射劑的上市［20-21］。如圖2 所示，不同于單層脂質(zhì)體（unilamellar vesicles，ULVs）和多層脂質(zhì)體（multilamellar vesicles，MLVs），DepoFoam?技術(shù)通過雙乳化工藝制備的脂質(zhì)體為多室脂質(zhì)體（multivesicular liposome，MVLs），呈現(xiàn)緊密堆積的非同心圓囊泡結(jié)構(gòu)，其緩釋機(jī)制主要是內(nèi)部囊泡的聚集融合和藥物從緊密堆積結(jié)構(gòu)中緩慢滲透［21］。同時，通過調(diào)整MVLs 處方或制備工藝（如甘油三酯類型、內(nèi)外溶液滲透壓），可實現(xiàn)對藥物釋放速率的調(diào)節(jié)。

Figure 2 Structures of different kinds of liposomes

2 原位制劑

2.1 植入劑

植入劑臨床使用時需要通過手術(shù)將其埋入組織或非手術(shù)形式塞入腔道內(nèi)，相比于微粒形式的儲庫往往具有更長的釋放周期。已上市的蛋白及多肽藥物的植入劑包括：組胺瑞林長效植入劑（商品名Vantas?）、醋酸戈舍瑞林緩釋植入劑（商品名Zoladex?）等。臨床試驗表明，在中樞性性早熟兒童體內(nèi)植入50 mg 劑量的Vantas?，可在兩年內(nèi)發(fā)揮有效治療作用［22］。用于腫瘤治療的Zoladex?是以PLGA 為基質(zhì)的乳白色植入棒，藥效持續(xù)時間可達(dá)1個月［23］。

在植入劑的研究中，如何提高載藥量、減少藥物突釋、延長藥物作用時間是研究人員關(guān)注的重點。多數(shù)植入劑具有先快后慢的釋藥特點，導(dǎo)致植入早期存在發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險，而末期難以維持有效治療劑量。針對這一問題，有研究人員通過氫鍵作用交替涂覆PEG 化的鮭魚降鈣素和單寧酸形成植入膜，這種夾心膜結(jié)構(gòu)能夠在多種條件下實現(xiàn)零級釋放［24］。

植入劑與人工智能的結(jié)合可實現(xiàn)更加精準(zhǔn)的藥物控釋能力。為研究不同藥物對動物行為能力的影響，研究人員通過電路設(shè)計和材料篩選開發(fā)了四通道、光流控、可編程的腦部植入型探針，可在不限制動物行為的情況下，通過遙控精確控制不同藥物的腦部泵注［25］。2012 年，此類無線遙控的藥物智能儲庫首次用于人體，研究表明，通過編程無線控制人甲狀旁腺素（1-34）在體內(nèi)的脈沖釋放，可以維持長達(dá)20 d的有效劑量［26］。

2.2 可相變供注射用緩釋制劑

此類制劑可通過液體或半固體形式注射，并在注射處發(fā)生相轉(zhuǎn)變形成固態(tài)植入物［1］，相轉(zhuǎn)變可通過物理因素觸發(fā)（如溶劑和溫度變化等），也可通過化學(xué)交聯(lián)形成固體。供注射用緩釋制劑具有創(chuàng)口小、不易感染、患者順應(yīng)性好、緩釋時間長等優(yōu)點。

2.2.1 溶劑變化觸發(fā)的制劑固化 此類制劑注射前通常應(yīng)為具有良好通針性的前體溶液（即將蛋白/多肽、水不溶型載體材料和處方中的其他輔料溶解于可與水混溶的有機(jī)溶劑中），原位注射后，有機(jī)溶劑擴(kuò)散和/或被水替代，導(dǎo)致載體材料聚集/固化將蛋白或多肽包裹其中［27］。常使用的溶劑包括N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亞砜（DMSO）、乙醇、乙酸乙酯、三乙酸甘油酯等；常使用的高分子包括PLGA、PLA、聚乙醇酸（PGA）、聚己內(nèi)酯（PCL）、磷脂/甘油酯組合物等［1］。溶劑極性、聚合物的親水親油性及相對分子質(zhì)量均顯著影響蛋白或多肽的釋放。例如，高極性溶劑形成的植入物孔隙多，可能造成突釋；而極性較低的溶劑則相反，易于實現(xiàn)藥物的長期平穩(wěn)釋放［28］。但由于此類制劑前體溶液中使用的有機(jī)溶劑（其中DMSO 與NMP 最為常見）往往具有一定毒性，因此在制劑開發(fā)時應(yīng)充分考慮安全性和收益風(fēng)險比。研究人員以LR12 肽為藥物、PLGA 和PLA 為載體、三乙酸甘油酯為溶劑制備了前體溶液，該緩釋體系不僅可在體內(nèi)維持一周以上的持續(xù)釋放，還可以避免LR12 因二硫鍵交聯(lián)而產(chǎn)生無活性二聚體［27］。

本課題組以乙醇為溶劑、二油酸甘油酯和磷脂為基質(zhì)制備了可相變脂質(zhì)凝膠，實現(xiàn)抗PD-L1抗體（αPD-L1）和近紅外光熱劑IR820 的腫瘤原位共遞送［29］，通過人工光熱干預(yù)和自然溶蝕，實現(xiàn)長達(dá)1 個月的藥物持續(xù)釋放，并在多種動物模型表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性［29］。

2.2.2 溫度變化觸發(fā)的制劑固化 此類制劑的開發(fā)基于聚合物溶解度的溫敏特性，即一定濃度的聚合物達(dá)到特定溫度后可發(fā)生“溶膠-凝膠（solgel）”相轉(zhuǎn)變，而相變溫度受聚合物HLB 值和混合自由能影響［30］。此類制劑的“sol-gel”相轉(zhuǎn)變通常具有可逆性，原理如圖3 所示，經(jīng)典的溫敏型聚合物具有親疏水相間的三嵌段結(jié)構(gòu)，當(dāng)環(huán)境溫度升高至下臨界膠凝溫度（lower critical gelation temperature，LCGT），水-聚合物間的相互作用逐漸弱于聚合物-聚合物間的相互作用，從而導(dǎo)致聚合物自發(fā)形成混合膠束，發(fā)生膠凝化。當(dāng)溫度繼續(xù)升高到達(dá)上臨界膠凝溫度（upper critical gelation temperature，UCGT）時，聚合物鏈具有很高的動能，從而變?yōu)殡S機(jī)運動，恢復(fù)為溶膠態(tài)［31］。

Figure 3 Typical mechanism of thermo-sensitive gelation

泊洛沙姆（poloxamer）是最經(jīng)典的溫敏聚合物，其具有聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEOPPO-PEO）三嵌段結(jié)構(gòu)。然而，泊洛沙姆親水性強(qiáng)且機(jī)械強(qiáng)度較低，在給藥初期易發(fā)生突釋，并且生物相容性較差，易導(dǎo)致蓄積毒性［32］。為解決以上問題，研究人員設(shè)計了一種可生物降解的新型溫敏聚合物PLGA-PEG-PLGA，并通過篩選合適的相對分子質(zhì)量和嵌段比使制劑具有理想緩釋行為，例如，使用PLGA-PEG1500-PLGA（相對分子質(zhì)量：5 200）為載體可使鮭魚降鈣素在體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定釋放約30 d［33］。

此外，PBLA-PEG-PBLA［34］、PEG-PCL-PEG［35］、PEG-PLGA-PEG［36］、PEG-PCL-PLA-PCL-PEG［37］等聚合物在制備溫敏緩釋制劑中均有應(yīng)用。

2.2.3 化學(xué)交聯(lián)觸發(fā)的制劑固化 此類制劑通過化學(xué)鍵合使聚合物交聯(lián)，從而在注射部位固化。由于化學(xué)鍵合方式靈活多樣，因而可根據(jù)需求設(shè)計響應(yīng)特定環(huán)境的制劑。例如，Wang 等［38］將ROS敏感鏈TSPBA 與混有抗PD-L1 抗體和吉西他濱的PVA 溶液同時注射，利用TSPBA 將PVA 交聯(lián)形成ROS 敏感的凝膠系統(tǒng)，在腫瘤部位可持續(xù)3 d 釋放抗體。此外，利用不同化學(xué)鍵形成混合交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)［39］、形成席夫堿［40］、光觸發(fā)反應(yīng)［41］等技術(shù)進(jìn)行可相變凝膠的制備均有相關(guān)研究報道。

3 口服長效制劑

蛋白及多肽類藥物的口服吸收需要克服低pH環(huán)境、酶水解、腸黏膜屏障、首過效應(yīng)等諸多不利因素，因此，開發(fā)蛋白及多肽類藥物的口服劑型（尤其是長效緩釋類劑型）存在較大困難，但長期以來科研人員仍持續(xù)努力，口服長效制劑一直是熱點研究方向。

3.1 口服長效片劑/膠囊劑

口服制劑實現(xiàn)長效緩釋作用，需要延長其在消化道中的停留時間并避免藥物被降解。受到皮膚貼劑的啟發(fā)，研究人員開發(fā)了一類腸黏附藥物儲庫，其作用機(jī)制見圖4［42］。首先制備含藥的腸黏附片，并在其一側(cè)進(jìn)行水不溶性包衣，其到達(dá)腸道后，未包衣處的黏附層吸水并通過氫鍵等作用力與腸黏膜結(jié)合，而水不溶的包衣層對腸道中多種蛋白酶有物理隔離作用，防止藥物降解。例如，采用卡波普、果膠、羧甲基纖維素鈉物理混合物為腸黏附片基質(zhì)，在單側(cè)包裹乙基纖維素背襯層，可使鮭魚降鈣素的口服吸收顯著提高［43］。類似的結(jié)構(gòu)還被用來口服遞送胰島素和艾塞那肽［43-44］，均能有效增加藥物的口服生物利用度。

Figure 4 Schematic representation of mechanism of adhesion,drug release and absorption across intestinal epithelium from mucoadhesive devices[42]

3.2 口服微粒

口服小粒徑、正電荷且具有粗糙表面的微粒更易于在胃腸道滯留和被腸道吸收［45］；而對小顆粒進(jìn)行腸溶包衣則可有效避免酸影響?；诖?，研究人員采用聚乙烯亞胺混合胰島素制備納米粒，并依次涂覆水溶性聚合物羥丙甲纖維素（hydroxypropyl methylcellulose，HPMC）、混有崩解劑羧甲基淀粉鈉的聚甲基丙烯酸酯Eudragit?NE 和Aqoat?，達(dá)作用時間48 h 以上［45］；Zhao 等［46］采用SiO2作為胰島素的口服緩釋載體并在外包被腸溶材料，能夠在27 h 內(nèi)有效控制血糖水平。此外，研究人員還通過腸內(nèi)生成氣泡、加入蛋白酶抑制劑［47］、形成自乳化系統(tǒng)［48］等方法提高蛋白及肽類藥物的口服生物利用度、延長作用時間。

4 經(jīng)皮給藥

4.1 微針貼劑

蛋白和多肽類藥物往往具有較高的相對分子質(zhì)量，難以實現(xiàn)有效的皮膚滲透，而微針的出現(xiàn)有效解決了這一問題。微針貼劑系由微米級的小針組成陣列，并附著在背襯材料上制成的一種透皮制劑。微針的長度可以刺穿角質(zhì)層，卻不會達(dá)到神經(jīng)末梢，因此不會引起疼痛。微針貼劑已應(yīng)用于多種蛋白及多肽類藥物的遞送，包括干擾素α［49］、胰島素［50］、肽類疫苗［51］等。Qiu 等［52］制備了交聯(lián)水合基質(zhì)微針并載入胰島素，與皮下注射相比，使胰島素作用時間延長了3倍以上。

為提高微針在皮膚上固定的穩(wěn)定性，研究人員開發(fā)了可自膨脹微針。Seong 等［53］利用聚苯乙烯-聚丙烯酸嵌段共聚物吸水膨脹的特性，將其包裹在微針前端，刺入皮膚后尖端膨脹，與皮膚機(jī)械嵌合，可延長微針在皮膚中停留時間和模型蛋白的釋放時間。

此外，為使微針在體內(nèi)滯留時間更長，研究人員開發(fā)了一類前端可脫落的生物可降解微針。Chen 等［54］以PLA 作為微針基質(zhì)，使其刺入皮膚后脫落并停留在皮膚中，實現(xiàn)卵清蛋白疫苗持續(xù)釋放14 d。但這類微針不能夠保證針體完全扎入體內(nèi)，因此也有研究人員制備了刺入皮膚后可自發(fā)破碎成小顆粒微球的微針來解決這一問題［55］。

4.2 經(jīng)皮微粒給藥系統(tǒng)

脂質(zhì)體、傳遞體、固體脂質(zhì)納米粒、醇質(zhì)體等微粒系統(tǒng)也常被應(yīng)用于護(hù)膚品及治療皮膚疾病藥物的開發(fā)［56-57］。其中，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的傳遞體不同于大尺寸、彈性低的傳統(tǒng)脂質(zhì)體，其脂質(zhì)膜中摻入單鏈表面活性劑，具有高彈性可變形的優(yōu)點，有利于表皮屏障的穿透［58］。微粒穿透皮膚主要經(jīng)歷的途徑有細(xì)胞間脂質(zhì)途徑、跨細(xì)胞途徑與毛囊途徑，有研究表明，雖然毛囊在皮膚組織中占比較小，但微?？稍诿抑写鎯?0 d以上［59］。

5 總結(jié)與展望

通過緩釋注射劑、植入劑、口服制劑、經(jīng)皮給藥等制劑手段可以實現(xiàn)蛋白和多肽藥物的長效化，而不同技術(shù)手段具有不同的優(yōu)缺點（表1），研究人員在對此類藥物進(jìn)行劑型改良時除應(yīng)考慮劑型特點外，應(yīng)綜合考慮藥物特性、生物因素、臨床需求、生產(chǎn)成本等各方面因素。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前此類制劑研究仍主要集中于植入劑和注射用微球的開發(fā)，制劑開發(fā)的難點仍是篩選合適載體、提高藥物穩(wěn)定性、減少突釋和實現(xiàn)藥物平穩(wěn)釋放。而未來，隨著更多新材料、制劑新技術(shù)和微型芯片技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，響應(yīng)體內(nèi)生理指標(biāo)變化的智能釋放藥物將成為下一代緩控釋制劑的主要研究方向，為通過制劑手段實現(xiàn)蛋白及多肽藥物的長效化提供更多可選方案?？傊鞍准岸嚯念愃幬锏拈L效遞送具有重要臨床意義和廣闊的市場前景。

Table 1 Advantages and shortcomings of the current strategies on prolonging the action of protein and peptide therapeutics