劉艷霞，區(qū)靜怡，黃 穎，陳 星，陳意珊，江鴻雅，石亞玲

（廣州市第八人民醫(yī)院檢驗科，廣州 510440）

新型冠狀病毒性肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）是2019年底新發(fā)現(xiàn)的傳染病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO) 報道， 2019年12月獲悉湖北省武漢市出現(xiàn)不明原因肺炎病例,中國宣布該不明原因肺炎的病原體為新型冠狀病毒。COVID-19臨床癥狀以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛等癥狀，嚴重者可出現(xiàn)呼吸困難，甚至危及生命。目前COVID-19 的診斷手段主要有病原學核酸檢測。2020年3月3日新型冠狀病毒（2019-nCoV）特異性抗體也納入確診的標準，包括了IgM 和IgG 在內(nèi)的全部新型冠狀病毒抗體特異性抗體，既具有IgM 抗體檢測早期診斷的優(yōu)勢，又具有檢測IgG 抗體既往感染的特點[1]。截至文章投稿前，尚未有針對性的治療方案用于臨床，對治療密切相關(guān)的實驗室檢查指標也在研究當中。近年來，許多研究報道顯示淋巴細胞亞群與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展之間存在著密切的關(guān)聯(lián)[2-3]。本研究通過對216 例COVID-19 患者外周血淋巴細胞及其亞群進行分析，探討兩者在COVID-19 患者中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2020年2月14日～3月11日收治于廣州市第八人民醫(yī)院的216 例COVID-19 患者，其中普通組194 例（男性88 例，年齡15～91 歲；女性106 例，年齡16～82 歲），重型組15 例（男性11 例，年齡52～91 歲；女性4 例，年齡50～63歲），危重組7 例（男性5 例，年齡42～83 歲；女性2 例，年齡56～85 歲）。診斷依據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會《關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）的通知》[4]，COVID-19 確診依據(jù)為新型冠狀病毒核酸檢測陽性，或病毒基因測序結(jié)果與已知的新型冠狀病毒高度同源。分型標準為：普通型：具有發(fā)熱、呼吸道等癥狀，影像學可見肺炎表現(xiàn)。重型需符合下列任何一項：出現(xiàn)氣促，RR ≥30 次/分；靜息狀態(tài)下，指氧飽和度≤93%；動脈血氧分壓（PaO2）/吸氧濃度（FiO2）≤300mmHg；肺部影像學顯示24～48 h 內(nèi)病灶明顯進展＞50%者。危重型需符合以下情況之一：出現(xiàn)呼吸衰竭，且需要機械通氣；出現(xiàn)休克；并發(fā)其他器官功能衰竭需ICU 監(jiān)護治療。

1.2 儀器與試劑 白細胞分類計數(shù)采用希森美康的SYSMEX XN B3 全自動血細胞分析儀及其配套試劑。淋巴細胞亞群的檢測采用美國BD 公司的FACS Canto ⅡPlus 型流式細胞分析儀、FACS 溶血素、淋巴細胞亞群檢測試劑盒（流式細胞儀法-6 色）及TruCOUNT 絕對計數(shù)管。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：研究對象可能重復檢測，每份樣本作為獨立樣本檢測，本次研究的樣本總數(shù)共計1080 份，其中 799 份標本作白細胞與淋巴細胞計數(shù)檢測，281 份標本作淋巴細胞亞群樣本檢測。部分研究對象未行B 淋巴細胞和NK 細胞檢測。故B 淋巴細胞和NK 細胞的樣本數(shù)為普通組86 份，重型組12 份，危重組21 份。具體方法是空腹抽取靜脈血3ml 于EDTA-K2抗凝管中備用。

1.3.2 白細胞與淋巴細胞的檢測：SYSMEX XN B3全自動血細胞分析儀上機檢測。

1.3.3 淋巴細胞亞群的檢測：取抗凝標本50μl，放入TruCOUNT 絕對計數(shù)管,加入淋巴細胞亞群檢測試劑（流式細胞儀法-6 色）熒光標記抗體，振蕩混勻后，常溫避光孵育15min，分別加入450μl FACS溶血素（1X），振蕩混勻，常溫避光靜置10min，于BD FACS CantoⅡ Plus型流式細胞分析儀上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 COVID-19 患者外周血淋巴細胞計數(shù)比較 見表1。COVID-19 患者外周血淋巴細胞計數(shù)結(jié)果為普通組＞重型組＞危重組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。白細胞計數(shù)結(jié)果為普通組＜重型組＜危重組，危重組與重型組、普通組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。

表1 COVID-19 患者外周血白細胞計數(shù)與淋巴細胞計數(shù)結(jié)果比較

2.2 COVID-19 患者的外周血淋巴細胞亞群水平比較

2.2.1 COVID-19 患者的外周血T 淋巴細胞計數(shù)、CD4+T 淋巴細胞計數(shù)和CD8+T 淋巴細胞計數(shù)比較：見表2。結(jié)果為普通組＞重型組＞危重組，重型組、危重組與普通組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；重型組與危重組比較（除外CD8+T淋巴細胞計數(shù)P ＞0.05），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 COVID-19 患者外周血T 淋巴細胞亞群水平比較

2.2.2 B 淋巴細胞計數(shù)結(jié)果：見表3。為普通組＞危重組＞重型組，重型組、危重組與普通組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。NK 細胞計數(shù)結(jié)果為普通組＞重型組＞危重組，危重組與重型組、普通組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。

表3 COVID-19 患者外周血B 淋巴細胞和NK 細胞水平比較

3 討論

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是尚未完全被認識的新發(fā)傳染病，其傳染性強，人群普遍易感。目前，核酸檢測是確診COVID-19 的主要手段，實驗室檢查和影像學分析是疾病進展和療效評估的輔助參考。淋巴細胞是機體免疫應答功能的重要細胞成分，按其發(fā)生遷移、表面分子和功能的不同，可分為T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。淋巴細胞亞群是細胞免疫和體液免疫功能的重要指標，它能總體反映機體的免疫功能、狀態(tài)和平衡水平，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系。

大部分重癥急性呼吸綜合征（SARS）患者的淋巴細胞會減少，新型冠狀病毒（2019-nCoV）與蝙蝠SARS 同源性達85%以上，也有研究推測2019-nCoV 可能通過破壞免疫系統(tǒng)導致淋巴細胞減少[5]。有研究者提出，淋巴細胞減少在并發(fā)MODS 的患者持續(xù)存在；48 h 時循環(huán)淋巴細胞低于0.5×109/L 患者病死率高達45%，提示淋巴細胞數(shù)量可預測病情嚴重程度和預后[6]。表1 結(jié)果顯示，COVID-19 患者的外周血淋巴細胞計數(shù)水平均出現(xiàn)不同程度的降低，危重組淋巴細胞計數(shù)結(jié)果明顯低于重癥組與普通組（P ＜0.01）。結(jié)合本次研究結(jié)果與患者的臨床表現(xiàn)，對比相關(guān)研究結(jié)論，可以推斷淋巴細胞計數(shù)在預測COVID-19 患者病情進展方面具有一定的應用價值。有文獻報道COVID-19 早期白細胞計數(shù)減少或正常,隨著病情進展中性粒細胞數(shù)量增多，淋巴細胞進行性減少，在并發(fā)細菌感染時WBC 增高更明顯[7]。本研究白細胞計數(shù)在危重組中升高明顯（P＜0.01），重型組和普通組變化和差異并不明顯（P＞0.05），原因可能是由于危重組患者并發(fā)細菌感染或病情加重所致（病歷顯示危重癥患者中有4 例并發(fā)細菌感染，7 例伴有器官功能衰竭）。

隨著流式細胞術(shù)的發(fā)展，淋巴細胞亞群分析已廣泛應用于臨床，在免疫功能評估方面起到不可或缺的作用。T 淋巴細胞有不同功能的亞群，CD4+T 細胞可協(xié)助體液和細胞的免疫功能，發(fā)揮對抗細胞內(nèi)病原體感染作用，CD8+T 細胞作為抑制細胞能夠抑制B 細胞產(chǎn)生的抗體。在受到病毒感染時，受到機體變應原的刺激可導致 CD3+T 細胞、CD4+T 細胞水平異常，反映了機體T 淋巴細胞亞群的紊亂狀態(tài)，一定程度上間接反映了機體細胞免疫功能的情況[8]。有文獻報道，淋巴細胞減少癥與高致病性引起的冠狀病毒相關(guān)[9]。還有報道提出，在COVID-19 患者中，T 淋巴細胞計數(shù)顯著減少，存活者 T 淋巴細胞似乎功能衰竭[10]。由表2 結(jié)果可見，COVID-19 患者的T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞與CD8+T 淋巴細胞的絕對值計數(shù)處于較低水平，以危重組的下降幅度最大。由此可見，T 淋巴細胞及其亞群計數(shù)水平降低的程度隨病情的加重而增加，該結(jié)果與國內(nèi)外類似研究相符，提示T 淋巴細胞及其亞群的計數(shù)水平高低與COVID-19 患者病情輕重存在相關(guān)性，外周血T 淋巴細胞及其亞群計數(shù)水平可作為COVID-19 患者病情評估的一個指標。

B 淋巴細胞是參與獲得性體液免疫應答的主要細胞，在抗原刺激和 Th 細胞輔助下，B 淋巴細胞分化為漿細胞，產(chǎn)生抗體，行使體液免疫功能。表3 結(jié)果可見，普通組B 淋巴細胞絕對計數(shù)基本處于健康人群的參考范圍內(nèi)，而重型組與危重組的B 淋巴細胞水平遠低于普通組（P ＜0.01）。由此推斷在COVID-19 患者中，B 淋巴細胞也可能存在損傷或者是被消耗。然而，B 細胞主要通過產(chǎn)生免疫球蛋白IgG，IgM 和IgA 等參與體液免疫，COVID-19患者中B 淋巴細胞的計數(shù)與體液免疫功能的關(guān)系、特異性免疫球蛋白產(chǎn)生的時間和效價、對疾病的診療和預后判斷有待進一步研究。

自然殺傷細胞（NK）是不同于T,B 淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，可以釋放多種細胞因子，對機體免疫功能進行調(diào)節(jié)，增強機體早期抗感染免疫能力。有研究指出，外周血自然殺傷細胞數(shù)量可用于預測全身性感染患者預后的情況[11]。本研究中，外周血NK 細胞計數(shù)水平在COVID-19 患者中也出現(xiàn)不同程度的降低，危重組降低最為顯著。因此NK細胞水平可考慮作為COVID-19 患者病情評估的一個指標。當然，NK 細胞水平存在明顯的個體差異，建議聯(lián)合其他指標綜合判斷。

綜上所述，對COVID-19 患者外周血淋巴細胞及淋巴細胞亞群進行分析，在反映COVID-19 患者機體免疫系統(tǒng)受損程度及評估病情方面具有一定的臨床應用價值。