侯 娟，蔣樹立，滕長財(cái)（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州 256603）

關(guān)鍵字：卵巢癌；miR-301b；抑癌因子;腫瘤基因圖譜數(shù)據(jù)庫

卵巢癌是女性中第五大致死的惡性腫瘤，截止2014年美國統(tǒng)計(jì)的新發(fā)病例為21 980 例，死亡人數(shù)為14 270 例，這其中90%為上皮性卵巢癌，而外科手術(shù)后聯(lián)合順鉑和紫杉醇化療的程序仍然是上皮性卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[1-2]。因此，發(fā)現(xiàn)并研究卵巢癌發(fā)病的分子特性對(duì)于提出更好更有效的治療方法是必要的。

MicroRNAs 是一種可以調(diào)控基因表達(dá)的短的（～22nt）內(nèi)源性的單鏈RNA 分子，成熟的miRNA和Argonaute 蛋白形成了RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），這種核糖核蛋白體的復(fù)合物調(diào)控了轉(zhuǎn)錄后基因的沉默，通過堿基配對(duì)的方式，miRNA 引導(dǎo)RISC 與信使RNA 結(jié)合，Ago 蛋白促使mRNA 降解或抑制其表達(dá)[3-4]。miRNA 的調(diào)控功能影響了細(xì)胞的信號(hào)通路，大部分這些通路控制著發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖、分化和腫瘤的發(fā)展遷移等生理過程[5-6]。因此，干擾miRNA 的功能會(huì)影響到腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療。

miR-301b 作為一種促癌因子已在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，如在胰腺癌中miR-301b 影響了轉(zhuǎn)錄因子的作用[7]，在三陰性乳腺癌和結(jié)腸癌中miR-301b出現(xiàn)高表達(dá)的結(jié)果[8]，在從巴雷特食管癌到食管腺癌的發(fā)展過程中，miR-301b 的表達(dá)量明顯升高[9]，而在急性髓系白血病病人的血漿中miR-301b 出現(xiàn)高表達(dá)，化療后表達(dá)量降低[10-11]。因此，對(duì)miR-301b 仍然不充分，為了進(jìn)一步研究miR-301b 在卵巢癌中的作用，筆者用TCGA 數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過在線數(shù)據(jù)庫獲取公開的臨床病例數(shù)據(jù)，并對(duì)臨床病例中miR-301b 的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；預(yù)測miR-301b 的靶基因并進(jìn)一步分析其生物學(xué)功能。文章中所涉及的數(shù)據(jù)庫見表1。478 例卵巢癌患者的臨床信息以及miR-301b 的基因表達(dá)信息全部來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫,見表2。

表1 文章中應(yīng)用到的數(shù)據(jù)庫及軟件

表2 478 例卵巢癌患者的臨床資料特征

1.2 數(shù)據(jù)收集整理 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中的478例卵巢癌患者的信息，miR-301b 進(jìn)行單因素和多因素生存分析，判斷其是否與預(yù)后相關(guān)。478 例卵巢癌患者的總生存期（OS）定義為從診斷到死亡的生存時(shí)間，隨訪時(shí)間0～180 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間是40 個(gè)月，無疾病進(jìn)展生存（disease free survival，DFS）指手術(shù)開始至局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或最后一次隨訪的時(shí)間。將478 例卵巢癌患者的臨床資料依年齡、美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC） 癌癥臨床分期、美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive CancerNetwork，NCCN）腫瘤分級(jí)、腫瘤病發(fā)位置、術(shù)后腫瘤殘余等進(jìn)行分類納入生存分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism5.0 軟件和SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 法，Log-Rank 分析生存差異。運(yùn)用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析卵巢癌患者的生存影響因素，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入數(shù)據(jù)的基本特征 在TCGA 網(wǎng)站獲取478例卵巢癌患者的基因表達(dá)資料及臨床資料，見表2。年齡按照中位數(shù)分為高年齡組（≥59 歲）和低年齡組（＜59 歲）；臨床分期分為早期組（Ⅰ期+Ⅱ期）、晚期組（Ⅲ期+Ⅳ期）及未知；腫瘤等級(jí)分為低級(jí)別組（G1+G2）、高級(jí)別組（G3+G4）；病發(fā)位置分為單側(cè)組、雙側(cè)組；腫瘤殘余分為＜1.3cm 組和≥1.3cm 組；microRNA 按照表達(dá)量的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

2.2 單因素生存分析卵巢癌患者預(yù)后的影響因素見表3。對(duì)478 例卵巢癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素總生存分析和無進(jìn)展單因素生存分析，得出miR-301b 的高表達(dá)是卵巢癌患者總生存和無進(jìn)展生存的保護(hù)因素,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高年齡組是卵巢癌患者總生存的危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而AJCC 分期晚期組是無進(jìn)展生存的危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 多因素回歸分析卵巢癌預(yù)后的影響因素 見表4。以年齡（＜59 歲=0，≥59 發(fā)=1）、腫瘤等級(jí)（G1+G2=0，G3+G4=1）、病發(fā)位置（單側(cè)=0，雙側(cè)=1）、臨床分期（Ⅰ期+Ⅱ期=0，Ⅲ期+Ⅳ期=1，未知=2）、腫瘤殘余（＜1.3cm=0，≥1.3cm=1）、miR-301b（ 低表達(dá)=0， 高表達(dá)=1）為自變量，以生存結(jié)局（生存=1，死亡=0）為因變量，Cox 回歸分析顯示，miR-301b 高表達(dá)是卵巢癌患者總生存和無病生存的獨(dú)立影響因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 單因素分析478 卵巢癌患者預(yù)后因素與總生存和無進(jìn)展生存的關(guān)系

表4 多因素Cox 回歸分析478 卵巢癌患者預(yù)后因素與總生存和無進(jìn)展的關(guān)系

2.4 miR-301b 靶基因及作用位點(diǎn)預(yù)測分析 通過在線數(shù)據(jù)庫TargetScan, PicTar, miRanda 分別對(duì)miR-301b 進(jìn)行靶基因的預(yù)測并得出預(yù)測結(jié)果，筆者在TargetScan 數(shù)據(jù)庫中預(yù)測得到432 個(gè)靶基因，在miRanda 中預(yù)測得到7 900 個(gè)靶基因，在PicTar數(shù)據(jù)庫得到469 個(gè)靶基因，綜合三個(gè)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，選擇在三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果中均出現(xiàn)的靶基因，作為最終預(yù)測miR-301b 的靶基因。綜合預(yù)測結(jié)果得到12 個(gè)靶基因。筆者發(fā)現(xiàn)miR-301b與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)均位于其mRNA 的3’UTR 區(qū)，在3’UTR 區(qū)與靶基因結(jié)合后抑制靶基因的翻譯，從而降低了靶基因的表達(dá)水平。筆者對(duì)這12 個(gè)靶基因進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，TEAD1 和CPEB4 的表達(dá)量與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Kaplan-Meier 分析miR-301b 的表達(dá)量與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展并不是由單一的基因突變引起的，它是多種突變長期累積的結(jié)果。卵巢癌作為一種致死性比較高的惡性腫瘤，它的發(fā)生發(fā)展及治療過程受多種基因的影響，根據(jù)不同的分子表型會(huì)采用不同針對(duì)性的治療方式。microRNA 作為一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，對(duì)細(xì)胞生長、組織分化、疾病過程起到重要的調(diào)控作用，尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

miR-301b 作為一種對(duì)腫瘤具有重要作用的microRNA，在胰腺癌、肺癌等癌癥中miR-301b 作為一種促癌因子[14]，促進(jìn)胰腺癌和肺癌等疾病的進(jìn)展，并且預(yù)后較差。筆者通過對(duì)TCGA 中卵巢癌的臨床病例數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-301b 高表達(dá)卵巢癌患者預(yù)后較好。miR-301b 在卵巢癌中表現(xiàn)出了抑癌基因的作用，與在胰腺癌、肺癌等癌癥中原癌基因的作用相反[14]，筆者認(rèn)為出現(xiàn)這種情況是由于不同的腫瘤具有不同的分子表型，即使相同的分子在不同的腫瘤中具有不同甚至相反的作用。正是由于腫瘤的這種特性，在治療不同癌癥時(shí)會(huì)采用不同的治療手段，甚至相同部位的腫瘤會(huì)根據(jù)其分子分型的差異采取相應(yīng)的治療措施。通過本文對(duì)miR-301b 靶基因的分析及靶蛋白相互作用的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，部分靶蛋白及相互作用蛋白是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療具有重要意義的蛋白質(zhì)。筆者對(duì)預(yù)測所得靶基因進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)TEAD1 與CPEB4 與卵巢癌的預(yù)后相關(guān)。先前研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌和腎透明細(xì)胞癌中TEAD1 可以促進(jìn)其癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與筆者的生存分析結(jié)果一致，高表達(dá)TEAD1 是卵巢癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素[15-16]。研究報(bào)道在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中以及骨肉瘤中均發(fā)現(xiàn)CPEB4 可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CPEB4 在癌組織中的表達(dá)明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。這些研究與筆者數(shù)據(jù)分析的高表達(dá)CPEB4 卵巢癌患者預(yù)后差的結(jié)果相一致，CPEB4 屬癌基因，其表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥患者預(yù)后較差[17-19]。

miR-301b 表達(dá)量的變化會(huì)直接影響到其多種靶蛋白的表達(dá)，在細(xì)胞的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，這些靶蛋白的變化會(huì)在細(xì)胞產(chǎn)生多種信號(hào)，并使細(xì)胞的生理過程，如細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間的行為關(guān)系等發(fā)生變化，這些變化可能會(huì)使細(xì)胞朝向癌變的方向發(fā)展。miR-301b 對(duì)于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用，miR-301b 的研究對(duì)卵巢癌的診斷治療和預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床指導(dǎo)意義。