柴春艷,王 甜,劉婭萍,徐邦強(qiáng),趙 媛,李雅莉

（1.陜西省人民醫(yī)院西院一病區(qū)，西安710068；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004）

近年來，肺癌的發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢(shì),有研究證實(shí)隨著體重指數(shù)升高，肺癌發(fā)生率、死亡率顯著增高。瘦素（Leptin）是人類1994年發(fā)現(xiàn)的由肥胖基因編碼的多功能肽類激素，傳遞肥胖信號(hào)到大腦,參與動(dòng)物繁殖、造血和血管生成等重要生理過程[1]。Leptin 參與調(diào)節(jié)能量代謝，在調(diào)控飲食、平衡機(jī)體能量等過程中發(fā)揮重要作用，和惡性腫瘤導(dǎo)致的營養(yǎng)不良存在顯著的聯(lián)系，可作為評(píng)估腫瘤患者整體狀況和預(yù)后的一個(gè)新指標(biāo)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，Leptin 是一種新的促腫瘤生長因子，能激活腫瘤細(xì)胞的分化增殖,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力。本研究通過檢測(cè)肺癌患者血清及肺癌組織中Leptin 的表達(dá)，證實(shí)Leptin 在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義，為肺癌的早期診斷、基因靶向治療、預(yù)后評(píng)估提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取陜西省人民醫(yī)院支氣管肺癌標(biāo)本118 例，均為2012～2019年手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的標(biāo)本，24 例癌旁正常肺組織。男性支氣管肺癌患者60 例，女性支氣管肺癌患者58 例。依據(jù)WHO 肺癌的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類：鱗癌43例，腺癌45 例，小細(xì)胞肺癌30 例。依據(jù)2015年國際肺癌研究學(xué)會(huì)（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）標(biāo)準(zhǔn)分期：I 期28 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期28 例。有肺門和(或)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(簡稱轉(zhuǎn)移) 70 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48 例。

1.2 儀器與試劑 血清Leptin 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，采用Phoenix Pharmaceuticals Ine 試劑盒；免疫組化SP 法采用鼠抗人Leptin 單克隆抗體及SP 染色試劑盒均購于西安騰智醫(yī)學(xué)診斷試劑有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 所有病例均禁食12h 后，抽取清晨空腹靜脈血5ml，分離血清-20℃保存待測(cè)。血清標(biāo)本在檢測(cè)前室溫復(fù)融,為消除批間差異，實(shí)驗(yàn)為一次性完成。血清Leptin 嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.2 支氣管肺癌組織中Leptin 的表達(dá) 采用免疫組化SP 法檢測(cè)，用已知陽性切片作陽性對(duì)照，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.3 結(jié)果判定 在肺癌組織中，Leptin 主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞漿中，出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒判定為陽性細(xì)胞，每張切片連續(xù)觀察，選取5個(gè)高倍視野，在每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)1 000 個(gè)癌細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。由2 位病理科醫(yī)師采用雙盲法判定陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Pearson χ2檢驗(yàn)、Fisher’s 精確檢驗(yàn)、成組配對(duì)t 檢驗(yàn)比較不同臨床特征、病理類型等的免疫組化陽性比例。P＜0.05 判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Leptin 在肺癌患者血清中的表達(dá) 見表1。Leptin 在肺癌組患者血清中的濃度為3.6±1.5μg/L,明顯高于對(duì)照組(1.6±0.7μg/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.485，P=0.002)，兩組營養(yǎng)狀況參數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組血清Leptin 及營養(yǎng)狀況參數(shù)的比較(±s)

表1 兩組血清Leptin 及營養(yǎng)狀況參數(shù)的比較(±s)

項(xiàng)目 對(duì)照組 肺癌組 t P瘦素（μg/L） 1.6±0.7 3.6±1.5 3.485 0.002體重指數(shù)（Kg/m2） 20.1±2.8 18.3±1.5 0.853 0.400 ALB(g/L) 40.0±2.2 38.6±2.1 0.686 0.500 TSF (mm) 9.5±1.6 7.3±1.5 1.321 0.200

2.2 Leptin 在肺癌組織中的表達(dá)

2.2.1 Leptin 表達(dá)陽性率 Leptin 表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿中，陽性產(chǎn)物呈棕黃色彌漫分布。在118 例肺癌患者中Leptin 的表達(dá)陽性率為75.42%（89/118），在癌旁正常肺組織Leptin 表達(dá)陽性率為25.00%（6/24），兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.2 Leptin 蛋白表達(dá)與支氣管肺癌一般臨床特征的關(guān)系 見表2。Leptin 在60 例男性患者中陽性表達(dá)率為95.00%（57/60），在58 例女性患者中陽性表達(dá)率為55.17%（32/58），兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.237，P ＜0.05)。提示支氣管肺癌患者性別對(duì)Leptin 蛋白表達(dá)的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能與吸煙指數(shù)有關(guān)，本研究證實(shí)Leptin 在吸煙指數(shù)≥400 的患者中高表達(dá)，可作為Leptin 與其他理化因素協(xié)同致癌的有力證據(jù)。隨著肺癌患者分化程度的降低，Leptin 蛋白表達(dá)陽性率隨之升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，I+II 期與III+IV期肺癌患者中Leptin 表達(dá)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者中Leptin 蛋白表達(dá)陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.831，P=0.002）。本研究證實(shí)Leptin 表達(dá)與支氣管肺癌患者分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評(píng)估肺癌預(yù)后的指標(biāo)。研究證實(shí)Leptin 蛋白表達(dá)與支氣管肺癌患者的年齡、病理類型無明顯關(guān)系，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 Leptin 蛋白表達(dá)與支氣管肺癌臨床基本特征及病理、TMN 分期間的關(guān)系

圖1 Leptin 在腺癌中陽性表達(dá)SP×200

圖2 Leptin 蛋白在小細(xì)胞癌陽性表達(dá)SP×400

3 討論

Leptin[5]是含146 個(gè)氨基酸的肽類激素，由位于7q31.3 的肥胖基因編碼。瘦素作為一種肽類激素，它的生物學(xué)效應(yīng)是由瘦素受體介導(dǎo)的。Leptin mRNA 作為細(xì)胞因子，在下丘腦、肺、肝臟、腎臟、卵巢、胎盤、骨骼肌等組織中表達(dá)。Leptin 反映的靶器官是胎兒和成人肺組織，Leptin 參與促進(jìn)胎兒肺發(fā)育和成熟，并維持肺功能處于穩(wěn)態(tài)，在成人肺泡細(xì)胞的生理性和病理性增殖中發(fā)揮作用[6]。Leptin-LepR 系統(tǒng)作為內(nèi)分泌腺可以促進(jìn)良、惡性腫瘤上皮細(xì)胞內(nèi)的血管生成，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[7]，Leptin 受體在動(dòng)物和人細(xì)胞系中的高表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞增殖。越來越多的研究證明Leptin-LepR 系統(tǒng)參與了肺癌的發(fā)生、進(jìn)展和免疫應(yīng)答過程。

Leptin 誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞抵抗凋亡的機(jī)制：①Leptin通過抑制CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的激活，降低了磷酸化的蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase,PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）的信號(hào)通路活性，從而阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的凋亡，激活腫瘤細(xì)胞增殖[8]。②肺癌患者體內(nèi)Leptin-LepR 系統(tǒng)激活后，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)表達(dá)上調(diào),或直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，肺癌患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管的重塑被激活，肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移增加[9]。③促分裂素原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）Akt/mTOR 等信號(hào)通路的活化進(jìn)一步促進(jìn)Leptin 表達(dá)[10]。有研究證實(shí)[11]，Akt，mTOR 等磷酸化在肺癌組織中表達(dá)明顯增高，血管內(nèi)皮生長因子、Akt 和mTOR 基因的mRNA 表達(dá)水平在肺癌組織中也較癌旁肺組織明顯升高，在肺癌組織中Leptin 特異性高表達(dá)的特性，在腫瘤的基因診斷及靶向治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺癌組織中Leptin 表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織，也進(jìn)一步印證了這一觀點(diǎn)。

本研究證實(shí)肺癌患者血清Leptin 明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示肺癌患者體內(nèi)存在顯著的能量消耗、脂肪分解。這與WERYNSKA 等[13]研究結(jié)果一致，認(rèn)為腫瘤患者出現(xiàn)食欲減退、惡病質(zhì)等消耗癥狀與多種炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)Leptin 生成增加有關(guān), 即“細(xì)胞因子-瘦素”學(xué)說。但陶曉南等[14]研究結(jié)果卻顯示肺癌患者組的血清Leptin 水平低于對(duì)照組，造成研究結(jié)果不一致的原因可能是入組患者臨床資料差異性，及晚期肺癌患者處于惡病質(zhì)狀態(tài)后的Leptin 水平調(diào)節(jié)突破了正常的生理范圍，肺癌并發(fā)惡病質(zhì)的患者體內(nèi)Leptin 水平調(diào)節(jié)具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探索。

支氣管肺癌患者臨床病理參數(shù)與Leptin 表達(dá)之間的關(guān)系目前仍存在爭議，本研究顯示支氣管肺癌患者的年齡、病理類型與Leptin 表達(dá)無關(guān)，性別與Leptin 表達(dá)顯著相關(guān)。肺癌患者的分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與 Leptin 表達(dá)有關(guān)，這與馮和林[15]等的研究結(jié)論一致，說明Leptin參與了肺癌的進(jìn)展過程，可以作為評(píng)價(jià)肺癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

本研究結(jié)果證實(shí)，支氣管肺癌患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Leptin 表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，說明淋巴結(jié)作為局部免疫器官，在支氣管肺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。Leptin 表達(dá)在重度吸煙患者中明顯高于不吸煙或少量吸煙者，提示Leptin 可能是吸煙致癌的重要分子標(biāo)志之一，而長期密切接觸煙草可能是啟動(dòng)Leptin 高表達(dá)的重要物理因素之一，這在國內(nèi)研究領(lǐng)域尚未涉及。

支氣管肺癌的早期癥狀大多不典型，放化療的臨床效果差，因此早期診斷及治療一直是個(gè)難題，考慮到“Leptin-Leptin 受體系統(tǒng)”在肺癌發(fā)生、進(jìn)展均發(fā)揮重要作用，煙草等外界理化因素可能導(dǎo)致其過表達(dá)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可以為腫瘤的早期診斷和治療提供新思路和新途徑。目前Leptin-LepR 系統(tǒng)在腫瘤局部微環(huán)境中發(fā)揮作用的機(jī)制尚未完全闡明，進(jìn)一步探討肺癌患者Leptin 表達(dá)對(duì)腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)的機(jī)制，有利于發(fā)現(xiàn)并逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，發(fā)現(xiàn)殺傷腫瘤細(xì)胞更高效的治療方法。