陳 培，鄧欽木，李丹丹

（重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科, 重慶 400010）

根據(jù)2017 全球癌癥數(shù)據(jù)庫，結(jié)直腸癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率分別為第四位和第二位[1]。2018年我國結(jié)直腸癌的新發(fā)病例數(shù)為52.15 萬人，因結(jié)直腸癌死亡患者4.79 萬人[2],并隨著經(jīng)濟的發(fā)展和居民生活方式的西方化在不斷增加[3-4]。研究數(shù)據(jù)表明，如果每年對居民定期篩查，可以避免結(jié)直腸癌中60%的死亡，并且其五年生存率可以從46%提高至73%[5]。因此，結(jié)直腸癌標志物的精準檢測對臨床治療、預后評估具有重要意義。

目前，結(jié)直腸癌的常見篩查方法為Septin9 甲基化（methylated Septin 9，mSEPT9)檢測、大便隱血試驗（fecal occult blood test, FOBT）、癌胚蛋白（carcino embryonic antigen, CEA）檢測以及腸鏡檢查。其中FOBT 和CEA 的敏感度和特異度較低，在結(jié)直腸癌的早期篩查中應(yīng)用價值有限[6]，腸鏡作為結(jié)直腸癌診斷的金標準，其特異度高，但是早期診斷不夠敏感，并且因其侵入性操作以及腫瘤異質(zhì)性而應(yīng)用有限。近年來，液體活檢在臨床上得到推廣，其具有非侵入式、易重復取樣以及無腫瘤異質(zhì)性等優(yōu)點[7]。尤其是循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）,它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。既往文獻報道，Septin9 基因甲基化與結(jié)直腸癌變過程密切相關(guān)[5]。本次研究擬通過熒光定量PCR 方法檢測血漿中mSEPT9 水平，探討mSEPT9對結(jié)直腸癌的診斷意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年6～11月在重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院接受腸鏡檢查的患者共100 例。將45 例經(jīng)腸鏡和病理檢測確診為結(jié)直腸癌的患者作為結(jié)直腸癌組，納入標準：參照《中國臨床腫瘤學會（ESCO）結(jié)直腸癌診療指南(2019 版)》綜合診斷為結(jié)直腸癌的患者。排除標準：既往其他腫瘤病史，已接受放化療、手術(shù)治療或全身治療，妊娠期、哺乳期婦女。將55 例經(jīng)腸鏡和病理檢測未診斷為結(jié)直腸癌的患者作為非結(jié)直腸癌對照組，包括結(jié)直腸腺瘤患者18 例，結(jié)直腸息肉患者27 例，結(jié)直腸無異常發(fā)現(xiàn)患者10 例。本次研究入選患者100例，男性45 例，女性55 例，年齡37 ～85 歲，平均年齡62.33±11.37 歲。45 例結(jié)腸癌患者均接受了mSEPT9 和CEA 檢測，其中31 例接受了FOBT 檢查。55 例非結(jié)直腸癌患者均接受了mSEPT9 檢測，其中39 例患者接受了FOBT 檢查，43 例患者進行了CEA 檢測。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：Septin9 甲基化檢測試劑盒（北京博爾誠），大便隱血（FOBT）檢測試劑盒（四川沃文特），癌胚蛋白檢測試劑盒（上海羅氏）。

1.2.2 儀器：SLAN-96S 熒光定量PCR 儀（上海宏石），沃文特全自動分析儀FA160（四川沃文特），Cobas 6000 型化學發(fā)光分析儀（上海羅氏）。

1.3 方法

1.3.1 Septin9 甲基化檢測：檢測流程按照試劑說明書進行，具體步驟如下：（1）提取血漿DNA；（2）亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化；（3）SLAN-96S PCR 儀上機；（4）按照試劑盒說明書對結(jié)果進行判讀。

1.3.2 大便隱血試驗：使用沃文特公司生產(chǎn)的自動化糞便分析儀上機檢測。

1.3.3 癌胚蛋白檢測：CEA 采用化學發(fā)光法檢測，結(jié)果由本院核醫(yī)學科提供。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS Statistics 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗，不同診斷方法符合率的比較采用ROC 曲線。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者年齡和性別分布情況 在100 例接受腸鏡檢查的患者中，結(jié)直腸癌組45 例，其中男性22 例，女性23 例，年齡35～82 歲，平均年齡61.89±12.50 歲；非結(jié)直腸癌組55 例，其中男性23 例，女性32 例，年齡43～85 歲，平均年齡62.69±10.48 歲。兩組間患者年齡差異無統(tǒng)計學意義（t=0.349, P=0.728），兩組間患者性別差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.500，P=0.480）。

2.2 結(jié)直腸癌組和非結(jié)直腸癌組中mSEPT9 檢測結(jié)果 見表1。結(jié)直腸癌組患者mSEPT9 陽性率為82.22%（37/45）。非結(jié)直腸癌組患者mSEPT9 陽性率為10.91%(6/55)，結(jié)直腸癌患者和非結(jié)直腸癌患者之間mSEPT9 檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.917, P ＜0.05）。將mSEPT9 檢測結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析顯示，mSEPT9 檢測結(jié)果與患者性別、年齡以及腫瘤部位無相關(guān)性(均P＞0.05)。

表1 mSEPT9 檢測結(jié)果與臨床特征關(guān)系[n=100，n（%）]

2.3 mSEPT9，F(xiàn)OBT 和CEA 在結(jié)直腸癌篩查中應(yīng)用價值的比較 見表2。mSEPT9 在結(jié)直腸癌中篩查中的特異度(89.09%)和陽性預測值(86.04%)高于FOBT(75.00%, 75.61%)，其敏感度(82.22%)和陰性預測值(85.96%)高于CEA(42.22%, 60.61%)。

表2 三種檢測方法在結(jié)直腸癌篩查中的應(yīng)用價值[%(95%CI)]

2.4 mSEPT 檢測結(jié)果與臨床病理分化程度關(guān)系 在低分化結(jié)直腸癌、中分化結(jié)直腸癌和高分化結(jié)直腸癌患者中，mSEPT9 的陽性率分別為80%（4/5），82.76%（24/29）和100%（2/2），另外，有9 例分化程度不明的結(jié)直腸癌患者，其mSEPT9 陽性率為78.78%（7/9）。統(tǒng)計學分析顯示，mSEPT9 檢測結(jié)果與臨床病理分化程度無相關(guān)性(χ2=0.447，P=0.800)。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中分別位列第二和第五，大多數(shù)結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)時已進入晚期，錯過了最佳治療時機。如果定期對居民篩查，可以顯著降低結(jié)直腸癌患者死亡率。液體活檢作為一種新興的檢測技術(shù)，在腫瘤的精準診斷和療效檢測中具有廣闊的前景，與傳統(tǒng)的穿刺活檢相比，其具有無創(chuàng)、低風險、低成本和高頻率檢測疾病進展等優(yōu)勢[7]。目前已發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化在基因表達及細胞增殖等過程中起重要作用，為腫瘤的無創(chuàng)診斷和療效監(jiān)測提供了新的手段[8]。

Septin9 基因位于人類染色體17q25.3，Septin9蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞成長，防止細胞分裂過快或以不受控制的方式進行分裂增殖，具有相應(yīng)的抑癌作用[9]。在結(jié)直腸癌變過程中，Septin9-v2 啟動子區(qū)的CpG 島發(fā)生高度甲基化，并且基因DNA 從凋亡壞死的癌細胞釋放入外周血。因此，通過檢測外周血中Septin9 特殊啟動子區(qū)域的甲基化水平可 以 推測患結(jié)直腸癌的風險[3,5,9]。既往研究發(fā)現(xiàn)mSEPT9 檢測結(jié)直腸癌的敏感度為36.6%～95.6%,特異度為77%～98.9%，其中在我國結(jié)直腸癌患者中，mSEPT9 的敏感度為69%～88%, 特異度為87%～98%[3]。本次研究結(jié)果顯示，mSEPT9 檢測結(jié)直腸癌的敏感度為82.22%，特異度為89.09%，與上述文獻報道結(jié)果一致。mSEPT9 檢測診斷結(jié)直腸癌的敏感度明顯高于CEA(42.22%), 特異度高于FOBT(75%)。但是，mSEPT9 診斷結(jié)直腸癌的敏感度低于FOBT（100%）,與YAN 等[6]分析結(jié)果相反，可能是因為未對所有患者進行FOBT 檢測，以及患者采集糞便樣本時依從性較差，其采集手法對結(jié)果影響較大。mSEPT9 篩查結(jié)直腸癌特異度略低于CEA（93.02%），可能是因為沒有對全部患者進行CEA 檢測。另外，本次研究還發(fā)現(xiàn)mSEPT9 檢測結(jié)果與患者性別、年齡、病例分化程度等沒有相關(guān)性（P＜0.05）。

本次研究存在一些不足之處，未對所有納入病例進行FOBT 和CEA 檢測，未分析mSEPT9 水平與結(jié)直腸癌臨床分期的關(guān)系。另外，本次研究中在部分胃癌、肝癌、肺癌和胰腺癌患者中發(fā)現(xiàn)mSEPT9 檢測結(jié)果為陽性，但由于樣本量不足，未做詳細分析。

綜上所述，mSEPT9 作為一個新的結(jié)直腸癌標志物，具有較高的靈敏度和特異度，并且具有無創(chuàng)、采樣方便、方法穩(wěn)定等優(yōu)勢，可以作為臨床診斷結(jié)直腸癌的輔助手段。