萬(wàn)笑笑

作者單位：江西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 南昌330006

缺血缺氧是導(dǎo)致急性腎損傷的重要原因，在缺血缺氧狀態(tài)下，機(jī)體炎癥信號(hào)通路被激活，并產(chǎn)生大量炎性因子加劇腎損傷［1-2］。核因子-κB（NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)的信號(hào)通路，與缺血再灌注損傷后引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［3-5］。miR-216a 是 miR-216家族成員之一，能夠廣泛地表達(dá)于心、肝、脾、肺、腎等組織中，并在胰腺中表達(dá)量最高，但在急性胰腺炎中低表達(dá)，并與胰腺損傷嚴(yán)重程度有關(guān)，因此被作為急性胰腺炎發(fā)作時(shí)胰腺損傷的潛在標(biāo)志物［6-8］，但miR-216a在急性腎損傷中表達(dá)情況未知，本課題組推測(cè)其可能作為急性損傷診斷的標(biāo)志物。同時(shí)miR-216a 能夠通過(guò)抑制高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/NF-κB 信號(hào)通路阻斷過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［9］，進(jìn)而提示miR-216a 對(duì) NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控作用。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子（Kruppel-like factor，KLF）是一類高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，有3 個(gè)亞族，KLF9 屬于亞族3，能夠通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體活化受體γ，進(jìn)而調(diào)控糖異生過(guò)程，因此KLF9是糖尿病腎病發(fā)生的標(biāo)志物［10］。所以本研究于2018年1—4月通過(guò)缺氧-復(fù)氧（H/R）復(fù)制體外急性腎損傷模型，進(jìn)而探討miR-216a在此模型中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料293T細(xì)胞（人腎上皮細(xì)胞系）、大鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞系RPTC購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。

胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液購(gòu)于Solarbio公司，批號(hào)T1300；Lipofectamine? 3000購(gòu)于invitrogen公司，批號(hào) 18882752；OPTI-MEM?I（1×）、MEM NEAA 培養(yǎng)基（100×）購(gòu)于gibco，批號(hào)331985-062、11140-050；DMEM培養(yǎng)基完全高糖培養(yǎng)液購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)KGM12800S-500；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物技術(shù)有限公司，批號(hào) D28310；Trizon Reagent、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒批號(hào)、UltraSYBR Mixture、miRNA Purification miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA Synthesis miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA qPCR Assay Kit購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)CW0580S、 CW0581M、 CW2569M、 CW0957M、CW0627S、CW2141S、CW2142S。

TGL16D臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)于常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；TCT8-II PCR儀購(gòu)于上海領(lǐng)成生物技術(shù)有限公司；YM100立式蒸汽壓力滅菌鍋購(gòu)于三申醫(yī)療器械有限公司；DHG-9070 電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)于上海恒科科技發(fā)展有限公司；C-1 厭氧袋購(gòu)于日本三菱；BPN-80CW 二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZOETM熒光細(xì)胞成像儀購(gòu)于Bio-Rad；SPARK10 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于TECAN；UV-1600PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于上海美譜達(dá)儀器有限公司；CFX Connect?實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀，Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)載體構(gòu)建運(yùn)用miRDB 軟件檢索出KLF9基因3'-UTR與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)：根據(jù)KLF9基因3'-UTR與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建熒光素酶載體，引入酶切位點(diǎn)（XhoI/XbaI）生物合成基因片段（克隆至pmirGL0載體上）。

1.3雙熒光素酶檢測(cè)將細(xì)胞分為KLF9野生型載體、miR-216a mimics（類似物）+KLF9 野生型載體、miR-216a NC（陰性對(duì)照）+KLF9 野生型載體。吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后用1×磷酸緩沖鹽溶液（PBS）潤(rùn)洗2遍后加入細(xì)胞裂解液；將樣本、螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑、Renilla 熒光素酶檢測(cè)試劑平衡至室溫后再進(jìn)行以下操作：每孔加入100 μL螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑，加入20 μL樣本，用移液器輕柔吹打混勻后讀數(shù)；以細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照；每孔加入100 μL Renilla 熒光素酶檢測(cè)試劑，使用酶標(biāo)儀震蕩混勻后讀數(shù)。在以Renilla熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)定得到的相對(duì)光單位（RLU）值除以Renilla 熒光素酶測(cè)定得到的RLU 值。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣本間目的報(bào)告基因的激活程度。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)6孔板中細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將不含血清的培養(yǎng)基取出復(fù)溫，細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，體積為1 mL；取滅菌的微型離心管（EP 管）2 個(gè)，每管加125 μL Opti-MEM。其中一管加入5 μL Lipofectamine? 3000；另一個(gè)EP管，加入5 μL P3000，質(zhì)粒2.5 μg，輕輕混勻后室溫靜置5 min；將上述兩個(gè)EP管混勻，室溫靜置60 min，將混合液滴到6孔板中對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4 h后在6孔板中加入血清含量為20%的完全培養(yǎng)基1 mL；48 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.5細(xì)胞H/R處理將大鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞系 RPTC 分為對(duì)照組，H/R 組，H/R+ miR-216a NC組，H/R+miR-216a mimics組。3個(gè)H/R細(xì)胞組進(jìn)行厭氧24 h 處理。H/R 模型復(fù)制：將3 個(gè)組的細(xì)胞放入?yún)捬鹾兄?，加入兩包厭氧袋后進(jìn)行厭氧，24 h取出細(xì)胞并更換無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)染。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）檢測(cè)提取各組RNA 后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（cDNA），以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，以U6為內(nèi)參，算出各組細(xì)胞中miR-216a的相對(duì)表達(dá)量；以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，算出各組細(xì)胞中KLF9、NF-κBp65、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：KLF9正向引物：5′-GGACACCTGGAAGGATTATTG-3′，KLF9 反向引物：5′-CTGGATGGGTCGGTATTTG-3′；NF-κB p65 正向引物：5′-AACTGGGTGACATCTGCTTCT-3′，NF-κB p65 反向引物：5′-TCTTCAGGTTCTTGGCTTCC-3′；TNF-α 正向引物：5′-TCGTAGCAAACCACCAAGC-3′，TNF-α 反向引物：5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′；VEGF-A 正向引物：5′-AAATCCTGGAGCGTTCACTG-3′，VEGF-A 反向引物：5′-ACCGCCTTGGCTTGTCA-3′；uPA 正向引物：5′-GTCAAGACCAAAGGCAAACA-3′，uPA 反向引物：5′-GATTCCGAAAACGGCTCA-3′；β-actin 正向引物：5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，β-actin 反向引物：5′-ATACCCAGGAAGGAAGGCT-3′；U6 正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-216a正向引物：5′-CACAGTGGTCTCTGGGATTATG-3′，miR-216a反向引物：康為世紀(jì)的通用引物。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析。定量結(jié)果采用xˉ±s表示。多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值，結(jié)果顯示，miR-216a mimics+KLF9 野生型共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性（0.67±0.02）顯著低于KLF9 野生型組（4.34±0.01）、miR-216a NC+KLF9 野生型共轉(zhuǎn)染組（4.45±0.21）的熒光素酶活性（F＝28.92，P＜0.001）。

2.2 miR-216a對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞系RPTC中miR-216a、KLF9表達(dá)量的影響與對(duì)照組比較，H/R 組及H/R+miR-216aNC 組中miR-216a 表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05），KLF9 表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；與H/R 組及H/R+miR-216aNC 組比較，H/R+miR-216a mimics 組中 miR-216a 表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05），KLF9 表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）。說(shuō)明miR-216a轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)能夠靶向下調(diào)KLF9表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 miR-216a對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞系RPTC中miR-216a、Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子9（KLF9）表達(dá)量的影響/xˉ± s

2.3 miR-216a對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞系RPTC中NF-κB p65、TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA表達(dá)量的影響與對(duì)照組比較，H/R組及H/R+miR-216aNC組中NF-κB p65、TNF-α、VEGFA、uPA mRNA表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；與H/R組及H/R+miR-216aNC 組比較，H/R+miR-216a mimics 組中NF-κB p65、TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 miR-216a對(duì)H/R誘導(dǎo)的大鼠腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞系RPTC中核因子-κB（NF-κB）p65、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）mRNA表達(dá)量的影響/xˉ±s

3 討論

miR-216a 是一種定位于染色體Zp16.1 的小分子非編碼RNA，是miR-216家族的一員，具有胰腺特異性。研究已經(jīng)證實(shí)miR-216a 在肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤組織中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-13］。另有報(bào)道表明急性胰腺炎SD 大鼠在胰腺損傷12 h后發(fā)現(xiàn)血清中miR-216a 表達(dá)量顯著增高，在24 h到達(dá)峰值，72 h后表達(dá)量有所降低，進(jìn)而miR-216a被認(rèn)為是急性胰腺炎所引起的胰腺損傷的標(biāo)志物［7］。miR-216a 通過(guò)靶向調(diào)控Y-框結(jié)合蛋白1（Ybx1）表達(dá)在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［7，14］。提示miR-216a在急性腎損傷的發(fā)生過(guò)程中也起著重要作用。同時(shí)miRNA 在細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用基本是通過(guò)其與靶基因的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。KLF9是一類高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，有17個(gè)家族成員，且家族成員典型結(jié)構(gòu)特征是有一個(gè)高度保守的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性及功能上的差異，此家族分為3個(gè)亞族，亞族1是典型的轉(zhuǎn)錄抑制子，包括KLF3、8、12；亞族2是轉(zhuǎn)錄激活子，包括KLF1、2、4、6、7；亞族3 根據(jù)其在細(xì)胞分化的不同階段被當(dāng)成激活子或者轉(zhuǎn)錄子，包括KLF9、10、11、13、14、16。其中KLF9 又被稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄序列結(jié)合蛋白1，能夠通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體活化受體γ，進(jìn)而調(diào)控糖異生過(guò)程。研究也顯示KLF9 是糖尿病腎病發(fā)生的標(biāo)志物［10］。本研究通過(guò)miRDB 軟件檢索出 KLF9 基因 3'-UTR 與 miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，并采用熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)KLF9 是miR-216a 下游靶基因。本研究接著用H/R 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞復(fù)制體外急性腎損傷細(xì)胞模型，接著轉(zhuǎn)染miR-216a，qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H/R 誘導(dǎo)后miR-216a表達(dá)量下調(diào)，KLF9表達(dá)量上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-216a mimics 后，能夠顯著的下調(diào)KLF9 表達(dá)，提示miR-216a過(guò)表達(dá)能通過(guò)負(fù)性調(diào)控KLF9表達(dá)進(jìn)而抑制急性腎損傷。

腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷的重要原因，缺血引起腎近端小管產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，激活包括NF-κB在內(nèi)的炎癥信號(hào)通路［3，15］。NF-κB信號(hào)通路是一條不僅參與免疫細(xì)胞活化、增殖、分化及細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)通路，同時(shí)也參與了多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。經(jīng)典的NF-κB 包括2 個(gè)亞基，分別為p50、p65，也是其活性形式。NF-κB 在未受刺激時(shí)候，能夠與其上游信號(hào)蛋白IκB（NF-κB的抑制蛋白）結(jié)合并位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在受到外界刺激時(shí)，此復(fù)合物被降解，NF-κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究顯示NF-κB 啟動(dòng)子位點(diǎn)上含有多種炎性因子結(jié)合的位點(diǎn)，能夠調(diào)控多種炎性因子的表達(dá)［3，15-16］。且研究也顯示在急性腎損傷過(guò)程中NF-κB p65、TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達(dá)量上調(diào)，通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，能一定程度抑制這些炎性因子的釋放，緩解急性腎損傷程度［17-19］。本研究結(jié)果表明miR-216a mimics能顯著降低NF-κB p65 mRNA 表達(dá)，同時(shí)還能顯著下調(diào) TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達(dá)量，進(jìn)而抑制急性腎損傷引起的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，KLF9是miR-216a下游靶基因，miR-216a 過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)靶向下調(diào)KLF9 表達(dá)，并阻斷NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)TNF-α、VEGF-A、uPA mRNA 表達(dá)，最終抑制H/R 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞急性腎損傷。