何喜，王志強(qiáng)，林韜，胡萬寧，張明明

作者單位：唐山市人民醫(yī)院胸外科，河北 唐山063001

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial interstitial transformation，EMT）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，與腫瘤的增殖、遷移和侵襲，復(fù)發(fā)和預(yù)后不良關(guān)系密切，也是腫瘤放化療耐藥的重要因素［1］。體內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)生多提示食管癌預(yù)后不良，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，使食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增加［2-3］。研究表明，血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）在腫瘤中的高表達(dá)與EMT關(guān)系密切，其作為轉(zhuǎn)錄因子能夠下調(diào)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)［4］，同時(shí)亦能夠調(diào)節(jié)下游靶蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)并促進(jìn)EMT 的形成［5］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，SRF 在食管癌組織中的異常高表達(dá)，采用基因沉默方法降低SRF的表達(dá)，則能夠有效的在體外抑制食管癌細(xì)胞的增殖［6］。因此本研究于2019年1—12月擬采用轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）在體外誘導(dǎo)Eca-109 食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并觀察基因沉默SRF 對其的干預(yù)效應(yīng)，為開發(fā)食管癌新的基因治療提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑Eca-109食管癌細(xì)胞購置于中科院上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購置于美國GIBIO 公司；TGF-β1 購置于美國 peprotech 公司；SRF、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、GAPDH購置于美國santa cruz 公司；α-SMA 購置于英國abcam 公司；小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）產(chǎn)品購置于廣州銳博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Eca-109 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞次融合狀態(tài)后，實(shí)驗(yàn)分組為：（1）陰性對照siRNA 組：陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染6 h，更換無血清培養(yǎng)基24 h；（2）TGF-β1+陰性對照siRNA 組：陰性對照siRNA 轉(zhuǎn)染6 h，更換含5 ng/mL TGF-β1 誘導(dǎo) 24 h；（3）TGF-β1+SRF-siRNA組：SRF-siRNA 轉(zhuǎn)染6 h 后，更換含5 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)+SRF-siRNA。按照轉(zhuǎn)染手冊步驟進(jìn)行，每25平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入50 nmol/mL 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和10 μL siRNA 陰性對照或SRF-siRNA。siRNA陰性對照序列：正向序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ ，反 向 序 列 ：5′ -ACGUGACACGUUCGGA GAATT-3′；SRF-siRNA 序列：正向序列：5′-GCAAGGCACUGAUUCAGACTT-3′，反向序列：5′-GUCUGAAUCAGUGCCU UGCTT-3［6］。

1.2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將Eca-109 細(xì)胞按照6000個(gè)/孔種植于24 孔板，待細(xì)胞貼壁密度為80%時(shí)用200 μL槍頭劃痕，按照實(shí)驗(yàn)分組誘導(dǎo)48 h，分別于0 h 和48 h 在相同位置拍照，采用IPP 6.0 圖像分析軟件測量劃痕區(qū)域面積，并計(jì)算遷移百分比，即（0 h面積-48 h面積）/0 h面積×100%。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 常規(guī)制備細(xì)胞玻片，高壓修復(fù)及封閉內(nèi)源性過氧化物酶后，一抗E-鈣黏蛋白（1∶200）4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB 顯色，鏡下控制，蘇木素輕度復(fù)染，中性樹膠封片。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 采用RIPA 裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照20微克/泳道上樣，13%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；E-鈣黏蛋白、SRF、N-鈣黏蛋白、α-SMA、GAPDH 一抗（1∶1 000）4 ℃過夜，二抗（1∶3 000）37 ℃孵育45 min，ECL 發(fā)光。采用IPP6.0 圖像分析軟件測定條帶光密度值，以相應(yīng)內(nèi)參（GAPDH）的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。多組間采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，多重比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)的方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SRF基因沉默抑制TGF-β1介導(dǎo)的Eca-109食管癌細(xì)胞的遷移能力如圖1所示，方差分析結(jié)果顯示（F＝105.462，P＜0.001），方差齊（F＝1.519，P＝0.293）采用LSD-t檢驗(yàn)，與陰性對照siRNA 組（10.00±2.00）%相比較，TGF-β1+陰性對照siRNA組的遷移百分比為（50.67±4.73）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與TGF-β1+陰性對照siRNA相比較，TGF-β1+SRF-siRNA 組細(xì)胞遷移百分比為（29.00±3.00）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 SRF基因沉默抑制TGF-β1介導(dǎo)的Eca-109食管癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程如圖2 所示，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，E-鈣黏蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞膜，陰性對照siRNA 組可見明顯的E-鈣黏蛋白膜陽性表達(dá)，TGF-β1+陰性對照siRNA 組E-鈣黏蛋白膜陽性表達(dá)減少，與TGF-β1+陰性對照siRNA 組相比較，TGF-β1+SRF-siRNA組E-鈣黏蛋白膜陽性表達(dá)增多。

如圖3、表1 所示，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與陰性對照siRNA組相比較，TGF-β1+陰性對照siRNA組E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.001），而N-鈣黏蛋白、SRF、α-SMA 蛋白表達(dá)上調(diào)（均P＜0.001）；與TGF-β1+陰性對照 siRNA 組相比較，TGF-β1+SRF-siRNA組E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)（P＝0.001），而SRF、N-鈣黏蛋白、α-SMA 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.001；P＝0.001；P＝0.003），經(jīng)方差分析（LSD-t檢驗(yàn)），兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖3 血清應(yīng)答因子（SRF）基因沉默對E-鈣黏蛋白、SRF、N-鈣黏蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達(dá)的影響（蛋白質(zhì)印跡法）

表1 血清應(yīng)答因子（SRF）基因沉默對E-鈣黏蛋白、SRF、N-鈣黏蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達(dá)的影響/xˉ± s

目前研究發(fā)現(xiàn)，SRF 在多種腫瘤中，包括甲狀腺癌［7］、肝癌［8］、胃癌［9］等多種腫瘤中異常高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力有關(guān)［10-12］。SRF能夠與miR-199a-5p啟動子結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，而miR-199a-5p 則能夠與E-鈣黏蛋白mRNA 結(jié)合從而抑制其表達(dá)［4］。采用TGF-β1誘導(dǎo)Eca-109食管癌細(xì)胞，能夠顯著促進(jìn)其遷移和侵襲能力，下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)表型包括N-鈣黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）、Slug等蛋白的表達(dá)，同時(shí)通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白 D1 的表達(dá)從而促進(jìn)了 Eca-109 細(xì)胞的增殖［13］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，基因沉默SRF 能夠下調(diào)β-連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而抑制了Eca-109 食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［6］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠顯著上調(diào)SRF 的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Eca-109 食管癌細(xì)胞的遷移能力的提高，同時(shí)減少細(xì)胞間緊密連接蛋白（E-鈣黏蛋白）的表達(dá)，并促進(jìn)間質(zhì)表型（N-鈣黏蛋白、α-SMA）的改變，誘導(dǎo)了食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT。基因沉默SRF 則能夠顯著抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的Eca-109 食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT，并降低了其遷移能力。

圖1 血清應(yīng)答因子（SRF）基因沉默對轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）介導(dǎo)的Eca-109食管癌細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）

SRF 及其轉(zhuǎn)錄輔因子心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Myocardin-related transcription factors，MRTF）是調(diào)節(jié)肌動蛋白的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞黏附、細(xì)胞收縮、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，能夠與α-SMA 基因啟動子結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄［14-17］。在腫瘤研究中，α-SMA常作為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞或EMT 標(biāo)記物，與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)［18］。本研究結(jié)果也顯示，在TGF-β1誘導(dǎo)的Eca-109 食管癌細(xì)胞EMT 過程中，伴隨了α-SMA 表達(dá)的上調(diào)，而予以基因沉默SRF，能夠顯著抑制Eca-109食管癌細(xì)胞α-SMA 的表達(dá)。其他研究也顯示，在體外沉默SRF，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并能夠抑制 EMT 進(jìn)程［19］。綜上所述，SRF 在食管癌發(fā)生、發(fā)展中起到了較為重要的調(diào)節(jié)作用，可能是基因靶向治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

（本文圖2見插圖9-4）

圖2 E-鈣黏蛋白在Eca-109食管細(xì)胞中的陽性表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色×400）