張威，王帥，王喜梅，張帆

作者單位：洛陽東方醫(yī)院消化科，河南 洛陽471003

肝缺血再灌注（Ischemia reperfusion，IR）損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，由缺氧引起的細胞損傷，隨后是血流量和供氧量的恢復(fù)，從而導(dǎo)致細胞損傷［1］。IR損傷是肝移植、肝切除、失血性休克和肝衰竭等常見的臨床并發(fā)癥［2］。在肝移植病例中，IR損傷的發(fā)生引起10%病人早期移植失敗，在急性和長期的排斥反應(yīng)中發(fā)生率更高［3］。在肝IR 損傷過程中，缺血損傷不僅直接造成細胞損傷，還會引起急性炎癥反應(yīng)，進而加重肝細胞損傷、器官功能障礙和衰竭。目前，IR 損傷的機制尚不清楚，臨床仍然缺乏有效的預(yù)防策略，因此，迫切需要開發(fā)新的治療方法。葛根素主要提取自豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。既往研究表明，葛根素（Puerarin）或葛根素注射液在肝IR損傷中表現(xiàn)出良好的治療效果［4-6］，但其分子機制并未完全闡明。因此，本研究于2018年4月至2019年2月建立小鼠肝細胞缺氧-復(fù)氧（Hypoxia and reoxygenation，H-R）損傷模型來模擬IR 損傷，考察葛根素對H-R 損傷的小鼠肝細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)合miR-7 和核因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路進一步探索葛根素的作用機制，為葛根素在IR損傷中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器小鼠肝細胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco 公司，葛根素購于上海阿拉丁生化公司，miRNA 提取試劑盒購于上海Qiagen公司，胰酶、RIPA裂解液、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、佛波酯（PMA）購于美國Sigma公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，Lipofectamine 2000、實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購于美國賽默飛世爾有限公司，miR-7、anti-miR-7、miR-7 陰性對照（miR-con）、antimiR-7陰性對照（anti-miR-con）購于廣州銳博生物有限公司，β-肌動蛋白（β-actin）、細胞核相關(guān)抗原Ki-67、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、核因子-κB（NF-κB）p65蛋白抗體購于美國Cellular Signaling Technology 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于博士德生物公司。BD FACSCalibur流式細胞儀購于美國BD公司，酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng)小鼠肝細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每周換液2～3 次。待細胞生長至約80%融合度時，使用胰酶消化，按1∶4比例接種傳代。

1.3細胞轉(zhuǎn)染收集小鼠肝細胞，以1×105/mL的密度接種于6孔細胞板，當(dāng)細胞融合度達約80%進行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000試劑說明書操作，在細胞中轉(zhuǎn)染miR-7或anti-miR-7及miR-con、anti-miR-con。轉(zhuǎn)染24h后，進行H-R處理。

1.4實驗分組將生長狀態(tài)良好的小鼠肝細胞采用隨機數(shù)字表法分為正常組（未H-R處理正常小鼠肝細胞）：對照組（0 μmol/L葛根素處理小鼠肝細胞）、不同濃度葛根素組（分別用70 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L、560 μmol/L葛根素處理小鼠肝細胞）；HR組（H-R處理小鼠肝細胞）：對照組（0 μmol/L 葛根素處理小鼠肝細胞）、不同濃度葛根素組（分別用70 μmol/L、14 0 μmol/L、280 μmol/L、560 μmol/L葛根素處理小鼠肝細胞），以篩選最佳藥物劑量。

確定最佳藥物劑量后，對小鼠肝細胞進行分組，研究葛根素對H-R損傷小鼠肝細胞的作用。小鼠肝細胞采用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組（0 μmol/L 葛根素處理小鼠肝細胞）、葛根素組（280 μmol/L 葛根素處理小鼠肝細胞）、H-R 組（H-R 處理小鼠肝細胞）、H-R+葛根素組（280 μmol/L葛根素預(yù)處理小鼠肝細胞，并進行H-R 處理）、H-R+miR-con組（小鼠肝細胞中轉(zhuǎn)染miR-con 并進行H-R 處理）、H-R+miR-7 組（小鼠肝細胞中轉(zhuǎn)染miR-7 并進行HR處理）、H-R+葛根素+anti-miR-con 組（小鼠肝細胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-con，并進行280 μmol/L葛根素預(yù)處理和H-R處理）、H-R+葛根素+anti-miR-7組（小鼠肝細胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-7，并進行280 μmol/L葛根素預(yù)處理和H-R處理）、H-R+葛根素+PMA組（280 μmol/L 葛根素預(yù)處理小鼠肝細胞，并進行H-R 和NF-κB信號通路激活劑PMA 處理）。其中，葛根素預(yù)處理24 h。H-R處理均為缺氧3 h，復(fù)氧6 h［7］。

1.5四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測細胞活性小鼠肝細胞以1×105/mL 的密度接種于96 孔細胞板，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，37 ℃搖床孵育10 min，酶標(biāo)儀讀取各孔細胞在490 nm 波長處光密度（OD）值，細胞活性＝實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 qPCR檢測細胞中miR-7水平利用miRNA提取試劑盒提取細胞中總miRNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA），并以合成的cDNA為模板，U6為內(nèi)參，按照qPCR 試劑盒說明書步驟，于熒光定量PCR 儀進行反應(yīng)，檢測miR-7水平。miR-7正向引物序列為5′-AAAAAGAACACGTGGAAGGATAG-3′，反向引物序列為 5′-CCGCCTAACGTACCGCGAATTT-3′。實驗設(shè)置 3 次重復(fù)，以 2-ΔΔCt法計算 miR-7 相對表達量。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡調(diào)整各組細胞密度為1×106/mL，根據(jù)細胞凋亡試劑盒的說明，使用195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，10 μL碘化丙啶（PI），輕輕混勻，在室溫條件下避光孵育20 min，置流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.8蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測Ki-67、Bcl-2、Bax、磷酸化核因子-κB p65（p-NF-κB p65）和NF-κB p65蛋白表達各組細胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用5%脫脂奶粉于常溫條件下封閉1 h，加入一抗（1∶1 000稀釋），同時加入β-actin一抗（1∶1 000 稀釋）作內(nèi)參蛋白，4 ℃孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）充分漂洗，加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST充分漂洗，置化學(xué)發(fā)光液顯色，曝光，分析目的蛋白相對表達量。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計與分析。數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度葛根素對正常小鼠肝細胞和小鼠肝細胞H-R后細胞活性的影響MTT 法檢測結(jié)果顯示（表1），與正常對照組相比，不同濃度葛根素處理小鼠肝細胞后，細胞活性呈下降趨勢，70 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L 葛根素組細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P1＝0.935，P2＝0.385，P3＝0.116），560 μmol/L 葛根素組細胞活性顯著降低（P4＝0.001）。與H-R 對照組相比，不同濃度葛根素組預(yù)處理H-R小鼠肝細胞后，細胞活性隨葛根素濃度增加呈先升后降趨勢，70 μmol/L和560 μmol/L葛根素組細胞活性與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P1＞0.05，P4＞0.05），而140 μmol/L和280 μmol/L葛根素組細胞活性均顯著高于H-R 對照組（P2＜0.001，P3＜0.001）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明（表1、圖1），與正常對照組相比，不同濃度葛根素處理小鼠肝細胞后，70 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L葛根素組細胞中Ki-67蛋白表達量無明顯變化（P1＝0.691，P2＝0.552，P3＝0.06），560 μmol/L 葛根素組細胞中Ki-67 蛋白表達量顯著降低（P4＜0.001）。與H-R對照組相比，不同濃度葛根素組預(yù)處理H-R的小鼠肝細胞后，細胞中Ki-67 蛋白表達量隨葛根素濃度增加呈先升后降趨勢，其中70 μmol/L、140 μmol/L、560 μmol/L 葛根素組Ki-67 蛋白表達量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P1＞0.05，P2＞0.05，P4＞0.05），280 μmol/L 葛根素則顯著高于H-R對照組（P3＜0.001）。

表1 不同濃度葛根素對正常小鼠肝細胞和小鼠肝細胞缺氧-復(fù)氧（H-R）后細胞活性的影響/xˉ±s

2.2葛根素對小鼠肝細胞H-R后小鼠肝細胞凋亡的影響對細胞凋亡的檢測結(jié)果表明（圖2A，表2），相比于對照組，H-R 處理的小鼠肝細胞凋亡率大幅增加（P＜0.001）。相比于H-R組，葛根素+H-R組小鼠肝細胞凋亡率明顯降低（P＜0.001）。對Bcl-2 和Bax 蛋白表達的檢測結(jié)果顯示（圖2B，表2），與對照組比較，H-R處理的小鼠肝細胞Bcl-2蛋白表達量明顯增加（P＜0.001），而Bax蛋白表達量顯著降低（P＜0.001）。與H-R組比較，葛根素+H-R組小鼠肝細胞Bcl-2 蛋白表達量明顯升高（P＜0.001），而Bax 蛋白表達量顯著減少（P＜0.001）。

表2 葛根素對小鼠肝細胞缺氧-復(fù)氧（H-R）后細胞凋亡的影響/xˉ±s

2.3不同濃度葛根素對小鼠肝細胞中miR-7的表達qPCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組（1.00±0.07）相比，miR-7 表達量在 70 μmol/L（1.12±0.13）、140 μmol/L（1.35±0.11）、280 μmol/L（1.39±0.09）和560 μmol/L（1.49±0.09）濃度葛根素處理的小鼠肝細胞中呈上升趨勢（F＝12.320，P＝0.001；P1＝0.073，P2＜0.001，P3＜0.001，P4＜0.001）。與H-R 組（1.00±0.05）相比，miR-7 表達量在70 μmol/L（1.46±0.11）、140 μmol/L（1.73±0.15）、280 μmol/L（3.39±0.23）和560 μmol/L（2.73±0.26）濃度葛根素處理的小鼠肝細胞中呈先升后降趨勢，均顯著高于H-R 組（F＝90.663，P＜0.001；P1＝0.001，P2＜0.001，P3＜0.001，P4＜0.001）。

2.4過表達miR-7對小鼠肝細胞H-R后細胞凋亡的影響H-R 組小鼠肝細胞中的miR-7 表達量、細胞活性、Ki-67 蛋白表達量明顯低于對照組（均P＜0.001，圖3、表3），其細胞凋亡率、Bcl-2、Bax 蛋白表達受到顯著影響（均P＜0.001），結(jié)果同“2.2”。在小鼠肝細胞中轉(zhuǎn)染miR-7，并用H-R 處理，發(fā)現(xiàn)與H-R+miR-con組相比，過表達miR-7顯著提升miR-7水平，增強細胞活性（P＝0.001），降低細胞凋亡率（P＜0.001），提升Ki-67、Bcl-2 蛋白水平而減少Bax蛋白表達量（均P＜0.001）。

2.5干擾miR-7表達部分逆轉(zhuǎn)葛根素對小鼠肝細胞H-R后細胞凋亡的抑制作用miR-7 表達、細胞活性、細胞凋亡率、Ki-67、Bcl-2 和 Bax 蛋白表達在H-R 組或H-R+葛根素組小鼠肝細胞受到明顯影響（均P＜0.001，表4），結(jié)果同2.1～2.4部分。與H-R+葛根素+anti-miR-con組比較，H-R+葛根素+anti-miR-7組顯著降低miR-7 表達量（P＜0.001）、細胞活性（P＝0.013），明顯增加細胞凋亡率（P＜0.001），降低Ki-67、Bcl-2 蛋白水平而提高Bax 蛋白表達量（均P＜0.001，圖4、表4）。

2.6葛根素調(diào)控miR-7表達影響小鼠肝細胞H-R NF-κB信號通路蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示（圖5、表5、表6），H-R 組小鼠肝細胞中p-NF-κB p65 表達量高于對照組（P＜0.001），H-R+葛根素+PMA 組p-NF-κB p65 表達量高于 H-R+葛根素組（P＝0.001），H-R+葛根素組p-NF-κB p65表達量低于H-R組（P＜0.001），而在H-R+葛根素+anti-miR-7組小鼠肝細胞中，p-NF-κB p65 表達量高于H-R+葛根素+anti-miR-con組（P＜0.001）；H-R組、H-R+葛根素組、H-R+葛根素+PMA組、H-R+葛根素+anti-miR-con組和 H-R+葛根素+anti-miR-7 組中 NF-κB p65 表達量均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P1＝0.729，P2＝0.943）。

表6 葛根素調(diào)控miR-7表達影響小鼠肝細胞缺氧-復(fù)氧（H-R）核因子-κB（NF-κB）信號通路/xˉ± s

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測葛根素調(diào)控miR-7表達影響小鼠肝細胞缺氧-復(fù)氧（H-R）核因子-κB（NF-κB）信號通路：A為葛根素、激活劑佛波酯（PMA）對小鼠肝細胞NF-κB信號通路的影響；B為葛根素調(diào)控miR-7表達影響小鼠肝細胞NF-κB信號通路

3 討論

葛根素是一種異黃酮類衍生物［8］，具有抗氧化、降血糖、抗炎、抗凝血、抗腫瘤、改善微循環(huán)等活性［9-10］，在糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨質(zhì)疏松癥、高血壓和心血管疾?。?1-14］中擁有廣泛的應(yīng)用價值。資料顯示，在IR 損傷方面，葛根素表現(xiàn)出顯著的保護作用［15-16］，葛根素注射液可以顯著抑制大鼠肝臟IR損傷的肝細胞凋亡，從而實現(xiàn)保護作用［5］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)葛根素可以減輕小鼠肝細胞IR 損傷。不同濃度葛根素組作用于H-R損傷的小鼠肝細胞，細胞活性、Ki-67 蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。使用280 μmol/L 葛根素預(yù)處理后，H-R 損傷的小鼠肝細胞凋亡率和Bax蛋白表達量明顯減少（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。證實葛根素可以減輕小鼠肝細胞IR損傷，促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，這與前人研究［17］結(jié)果一致。

miR-7 作為腫瘤抑制因子，可以減少腫瘤細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡，如肝細胞癌，非小細胞肺癌和胃癌［18-20］。miR-7 還參與 IR 損傷，在心肌細胞H-R模型中，miR-7能夠抑制心肌細胞凋亡，干擾其表達則發(fā)揮相反的作用［21］。miR-7可以在一定程度上保護腦IR損傷，機制與調(diào)控PI3K/Akt信號通路活性，調(diào)控下游Bcl-2和Bax表達有關(guān)［22］。miR-7a/b對IR 損傷敏感，并通過在體內(nèi)和體外負調(diào)節(jié)聚（ADP-核糖）聚合酶表達來保護心肌細胞免受IR 誘導(dǎo)的細胞凋亡［23］。為探究葛根素保護小鼠肝細胞IR損傷的分子機制，本實驗用不同濃度葛根素預(yù)處理H-R 損傷的小鼠肝細胞，結(jié)果顯示，葛根素預(yù)處理后，H-R損傷小鼠肝細胞中的miR-7表達上調(diào)；在H-R 損傷小鼠肝細胞中，miR-7 表達顯著下調(diào)（P＜0.05）；干擾miR-7表達部分逆轉(zhuǎn)葛根素對小鼠肝細胞H-R損傷后細胞凋亡的抑制作用，這與Geng等［24］對姜黃素通過上調(diào)miR-7a/b 表達來保護缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞免受細胞凋亡的研究結(jié)果相符。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)過表達miR-7顯著增強H-R損傷小鼠肝細胞活性，降低細胞凋亡率，提升Ki-67、Bcl-2 蛋白水平而減少Bax蛋白表達量（P＜0.05）；干擾miR-7表達部分逆轉(zhuǎn)葛根素對小鼠肝細胞H-R損傷后細胞活性和Bcl-2蛋白水平的促進作用，以及對Bax蛋白表達的抑制作用。上述結(jié)果表明，miR-7 是葛根素保護小鼠肝細胞H-R損傷的重要調(diào)控因子。

NF-κB 主要包括 p65、RelB、c-Rel、p50 和 p52等，可以調(diào)節(jié)免疫、炎癥、細胞生存和增殖等相關(guān)基因。NF-κB 密切參與細胞凋亡，在不同類型的細胞和不同刺激中發(fā)揮著促凋亡和抗凋亡作用［25］。多項研究表明心肌細胞中NF-kB p65 活化是促凋亡的［26］。研究表明，葛根素通過顯著降低大鼠IR損傷后肝臟組織中NF-κB 蛋白和mRNA 表達，保護大鼠肝臟 IR 損傷［27］。唐東等［28］報道指出，在大鼠肝臟IR損傷處理中，NF-κB p65表達量顯著增加；使用葛根素預(yù)處理會明顯降低NF-κB p65 蛋白水平，與本研究結(jié)果相同。同時，使用NF-κB信號通路激活劑PMA 處理后，明顯提高H-R+葛根素組p-NF-κB p65蛋白表達。干擾miR-7表達部分逆轉(zhuǎn)葛根素對小鼠肝細胞H-R損傷后NF-κB p65表達的抑制作用。提示NF-κB信號通路是葛根素減輕肝細胞H-R損傷的重要途徑之一，葛根素可能通過調(diào)控miR-7 表達抑制NF-κB信號通路活性，從而發(fā)揮對肝細胞H-R 損傷的保護作用。

總之，葛根素能夠促進H-R 損傷的小鼠肝細胞增殖，并抑制細胞凋亡，其作用機制與調(diào)控miR-7表達，抑制NF-κB 信號通路活性有關(guān)，這將為治療肝IR損傷提供新思路。

（本文圖2見插圖9-3）

圖2 葛根素對小鼠肝細胞缺氧復(fù)氧后細胞凋亡的影響：A為流式細胞儀檢測細胞凋亡圖；B為葛根素對小鼠肝細胞缺氧復(fù)氧后小鼠肝細胞B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白表達的影響