劉慶東，白跳艷，王曄飛，姚楊

作者單位：1榆林市第一醫(yī)院，a消化內科，b肝膽外科，陜西 榆林719000；2西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，a檢驗科，b中心實驗室，陜西 西安710077

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率較高［1-3］。盡管肝癌的治療方法不斷進步，但仍然存在預后效果差、術后轉移或復發(fā)率高、對放化療不敏感等局限性［4-6］。因此迫切需要尋找安全有效的治療策略。槲皮素（quercetin）是一種天然的黃酮類化合物，能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖、轉移的作用［7-8］。迷迭香酸（rosmarinic acid）是一種廣泛分布的水溶性酚酸類化合物［9-10］。且具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用［11-13］。其抗腫瘤作用受到廣泛關注。但目前尚無文獻報道槲皮素聯(lián)合迷迭香酸對HepG2細胞的影響。本研究2018年1月至2019年1月選用人肝癌HepG2細胞為模型，觀察槲皮素與迷迭香酸聯(lián)合應用對HepG2細胞增殖及凋亡的影響，并探討其可能的作用機制，為其應用于肝癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料試劑：10%小牛血清（四季青生物工程公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，美國sigma 公司）；槲皮素及迷迭香酸購自美國Signal Chemical公司，RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）槲皮素及迷迭香酸用二甲基亞砜（DMSO）超聲溶解，配成不同質量濃度的溶液，然后用0.22 μm微孔濾器過濾，滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），96孔板、6孔板（美國Thermo Fisher Scientific 公司），流式細胞儀（FranklinLakes），全自動酶標儀（美國Molecular Devices 公司），實時定量PCR 儀（美國Bio-Rad），離心機（美國Bio-Rad）。

1.2 HepG2細胞培養(yǎng)及分組將HepG2細胞復蘇后，37 ℃、5%二氧化碳孵箱內培養(yǎng)培養(yǎng)。其中RPMI-1640 培養(yǎng)基內含3%小牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL。每2～3 天傳代換液1 次，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞以5×104/mL 接種至96 孔板中培養(yǎng)24 h。分為空白對照組（只加DEME培養(yǎng)液），槲皮素單獨處理組（DMEM 培養(yǎng)液+DMSO+12.5、25.0、50.0 和100.0 μmol/L 槲皮素溶液），迷迭香酸單獨處理組（DMEM 培養(yǎng)液+DMSO+12.5、25.0、50.0 和 100.0 μmol/L 迷迭香酸溶液）單藥及聯(lián)合用藥組（DMEM培養(yǎng)液+DMSO+IC50 槲皮素+IC50 迷迭香酸），各組培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞活力將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞以5×104/mL接種至96孔板中培養(yǎng)24 h，每孔200 μL倒掉培養(yǎng)液，按照上述分組操作，再培養(yǎng)24 h后棄液，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 溶液150 mL，放至搖床低速振蕩10 min，使各孔結晶物充分溶解，采用全自動酶標儀在570 nm處測各孔吸光度。

1.4劃痕實驗將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞接種到6孔板，調整細胞密度為5×105/mL，搖勻后與37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜，用記號筆在6 孔板底部畫3 條水平直線，常規(guī)培養(yǎng)至90%融合狀態(tài)。用移液器在細胞板上劃痕，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗以去除懸浮細胞，同時在各藥物組中分別加入用1.5%血清培養(yǎng)基配置的不同濃度迷迭香酸及槲皮素，鏡下記錄劃痕寬度并拍照。37 ℃、5%二氧化碳體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合程度并拍照。計算各組劃痕距離。

1.5蛋白質印跡法檢測蛋白表達收集上述各組細胞，BCA 法測定蛋白濃度，取50 μg 等量蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉液室溫封1h，加入一抗N-鈣黏蛋白（N-cad）（1∶300），E-鈣黏蛋白（E-cad）（1∶500），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（1∶500）。4℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。以GAPDH 為內參計算各組目的蛋白的表達水平。

1.6統(tǒng)計學方法計量資料xˉ±s表示，多組定量數(shù)據的比較采用單因素方差分析的方法，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗，所有數(shù)據采用SSPS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖結果12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L槲皮素對HepG2細胞抑制率分別為（16.9±3.2）%，（28.9±3.4）%，（39.6±4.2）%，（53.5±2.3）%，12.5，25，50，100 μmol/L 迷迭香酸對HepG2細胞抑制率分別為（5.2±1.2）%，（12.3±1.6）%，（39.8±2.1）%，（62.5±3.4）%；以上結果表明不同濃度槲皮素及迷迭香酸單獨作用于HepG2細胞均表現(xiàn)出濃度依賴性的細胞活力抑制效果，但是抑制率仍然不高。二者聯(lián)合處理人 HepG2細胞 24 h 后，12.5、25.0、50.0 和 100.0 μmol/L 對HepG2細胞抑制率分別為（25.1±3.5）%，（52.3±4.2）%，（62.5±5.1）%，（78.2±3.6）%，可顯著抑制細胞活力（F＝4.25，P＝0.02）。

2.2劃痕實驗結果25 μmol/L 迷迭香酸組及25 μmol/L槲皮素組均能抑制細胞的遷移，劃痕愈合距離分別為（11.35±2.37）mm、（11.46±3.86）mm。迷迭香酸及槲皮素聯(lián)合組劃痕愈合距離為（4.36±0.56）mm，細胞間劃痕距離縮小趨勢較迷迭香酸及槲皮素單獨使用有所減緩（F＝6.73，P＝0.003）。該結果提示槲皮素及迷迭香酸聯(lián)合組能顯著抑制細胞遷移。

2.3相關分子含量檢測蛋白質印跡法檢測結果表明：與對照組相比，槲皮素組及迷迭香酸組中N-cad蛋白表達水平下降，其蛋白相對表達量為（0.98±0.05）及（0.73±0.02）。E-cad 蛋白表達增加，其蛋白相對表達量為（1.02±0.10）及（1.25±0.14），而槲皮素+迷迭香酸組N-cad（0.61±0.07）及 E-cad（1.42±0.06）蛋白表達變化更加明顯（N-cad：F＝3.28，P＝0.03；E-cad：F＝5.28，P＝0.02）。見圖1。

圖1 蛋白質印跡法檢測各組E-鈣黏蛋白（E-cad）和N-鈣黏蛋白（N-cad）基因表達

3 討論

肝癌病死率高，預后效果不理想，治療難度大，因此迫切需要尋找一種有效治療肝癌的臨床藥物［14］。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、防癌、抗癌等作用［15-16］。迷迭香酸是一種天然的苯酚羧酸，以唇形科和紫草科含量最高。迷迭香酸具有抗癌、抗過敏、抗氧化、抗炎等作用［17］。

上皮-間質轉化（EMT）是惡性腫瘤浸潤與轉移的重要因素，其過程涉及許多EMT 相關蛋白的參與。其中E-cad 和N-cad 被認為是最顯著的標志蛋白。E-cad 表達于細胞膜表面，是一個與鈣離子有高度結合親和力的一種細胞黏附糖蛋白，對維持細胞間的通訊與黏附有重要作用，在多種惡性腫瘤的遷移侵襲階段占重要地位。張杰東等［18］研究發(fā)現(xiàn)E-cad 在甲狀腺乳頭狀癌中低表達，與甲狀腺乳頭癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移中起重要作用，可作為臨床診斷和預后的指標。羅婷婷等［19］研究發(fā)現(xiàn)E-cad能有效抑制鼻咽癌CNE-2細胞的體外遷移和侵襲。N-cad 可以克服E-cad 介導的細胞間牢固的黏附而影響上皮細胞的形態(tài)和行為，促進腫瘤細胞浸潤。但關于兩種蛋白在肝癌防治機制中的研究卻較少。

本研究以人肝癌HepG2細胞為模型，考察迷迭香酸與槲皮素聯(lián)用對N-cad 及E-cad 表達的影響，結果顯示，兩藥聯(lián)合能明顯抑制肝癌HepG2 細胞的活力，抑制細胞遷移，并呈現(xiàn)濃度依賴關系，并通過蛋白質印跡法檢測發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合使用較單獨應用迷迭香酸可顯著上調E-cad 和下調N-cad 蛋白的表達。這說明槲皮素增強迷迭香酸對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用的機制可能是通過調控E-cad、N-cad蛋白的表達，其機制可能與EMT有關。為肝癌的臨床治療提供了有力的實驗證據。