段會娟

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，河南 洛陽 471003)

免疫組織化學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為當今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項有力的工具，其應(yīng)用范圍深達醫(yī)學(xué)的各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一。免疫化學(xué)實驗時主要采用組織標本與細胞標本，若形態(tài)保存良好，可連續(xù)進行切片，用于各種染色觀察。但是標本組織制作時甲醛的固定過程可導(dǎo)致細胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羥甲基等從而引起抗原的決定簇被封閉。在組織固定過程中，甲醛與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，可封閉抗原，因此在免疫組織化學(xué)染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)陽性物反應(yīng)不強，時隱時現(xiàn)，表達不均勻，有時可出現(xiàn)假陰性。因此為了較好地暴露抗原，需進行抗原修復(fù)[1]。常用的抗原修復(fù)法有微波修復(fù)法、高壓加熱法、酶消化法、水煮加熱法等，雖然進行免疫組織化學(xué)染色可借助抗原修復(fù)程序，但是設(shè)備成本較高，手工操作法仍是較為普遍的使用方法，各個實驗室會根據(jù)自身的習慣等選擇不同的修復(fù)方法?；诖?，本研究對比不同抗原修復(fù)方法在免疫組織化學(xué)染色中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 材料收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年10月至2019年11月95例手術(shù)送檢的食管癌組織標本，均經(jīng)福爾馬林固定，脫水后石蠟包埋。標本進行連續(xù)切片，厚度約為4 μm，并放入載玻片內(nèi)(經(jīng)過防脫處理)，放置于60 ℃烤箱中烤6 h左右。

1.2 試劑及儀器試劑包括CD8、CD4、Ki67、白介素-17(interleukin 17，IL-17)、pH為6.0的枸櫞酸液、pH為7.2的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒。所有試劑盒均選購自北京諾博萊德公司。儀器包括高壓消毒鍋、微波爐等。

1.3 操作方法將石蠟標本進行脫蠟水化后，置于體積分數(shù)0.3%的H2O2甲醛中浸泡10 min，氧化物活性消除后開始抗原修復(fù)。(1)高壓抗原修復(fù)法：將切片放置于枸櫞酸鹽緩沖液(約2 000 mL)中，放置于高壓鍋內(nèi)加熱至沸騰，蓋上壓力閥后至噴汽后持續(xù)1～4 min，取出修復(fù)液恢復(fù)室溫后，采用PBS沖洗3次，然后按照選好的免疫組織化學(xué)法進行染色。(2)水浴修復(fù)法：將盛有修復(fù)液的耐高溫染色盒放置于水浴鍋中，加熱到95～99 ℃，加入切片(甩干水分)，采用保溫檔(不擰緊壓力閥)，處理20 min左右，然后將染色盒與切片一起放置于冷水中進行隔水降溫，冷卻后，沖洗玻片上的修復(fù)液，然后進行染色處理。(3)微波輻射抗原修復(fù)法：將枸櫞酸液放置于微波爐內(nèi)的高溫塑料切片架上，并將切片豎立其中，在微波爐內(nèi)輻射20 min，取出后處理與高壓抗原修復(fù)法一致。

1.4 評價指標對3種方法修復(fù)后的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進行分析。陽性標準為：CD8、CD4細胞膜顯示棕黃色，Ki67細胞核、IL-17細胞質(zhì)顯示棕黃色。根據(jù)呈現(xiàn)的顏色進行計分：不著色計0分，深棕黃色計1分，棕黃色計2分，深棕色計3分。根據(jù)陽性細胞的百分率進行評分，其中百分率<5%為0分，5～25%為1分，26%～75%為2分，>75為3分。根據(jù)以上兩項得分之和將細胞陽性程度劃分為陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)、強陽性(+++)，其分別為0～1分、2～3分、4～5分、6分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，陽性率用率(%)表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用高壓抗原修復(fù)法修復(fù)，CD4抗體陽性率較其他兩種方法高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。三種抗原修復(fù)法下CD8、Ki67、IL-17抗體陽性率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。高壓修復(fù)法CD8、CD4、IL-17強陽性占比高于微波輻射修復(fù)法、水浴修復(fù)法(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組不同抗原修復(fù)法后免疫組織化學(xué)染色結(jié)果對比(n，%)

3 討論

免疫組織化學(xué)染色主要利用抗原抗體的特異性原理，通過一系列的化學(xué)反應(yīng)來對抗體進行顯色，從而對抗原進行有效研究。其技術(shù)可將抗原的形態(tài)特點、功能等變化結(jié)合起來，可精確地反映亞細胞結(jié)構(gòu)水平。但是，制作組織標本時主要采用甲醛進行固定，可造成部分抗原決定簇被封閉，因此進行染色時部分標本組織無法顯色，所以需對抗原進行修復(fù)或使其暴露，恢復(fù)其原有的空間形態(tài)[2-3]?？乖迯?fù)的方法目前還未標準化，暫時還未發(fā)現(xiàn)任何一種抗原修復(fù)法適用于各種抗體，抗原的修復(fù)效果受到多種因素的影響，臨床實際操作過程中需不斷提高免疫組織化學(xué)技術(shù)水平，從而為病理診斷提供更為可靠的依據(jù)。

枸櫞酸鹽緩沖液pH為6.0，比較適用于大多數(shù)抗原，修復(fù)方法較多，如微波輻射抗原修復(fù)法、高壓抗原修復(fù)法、水浴修復(fù)法等。微波輻射抗原修復(fù)法主要利用微波的快速運動產(chǎn)生的瞬間熱作用來達到抗原修復(fù)的目的，微波輻射可以使各種物質(zhì)分子進行極性運動，從而導(dǎo)致已經(jīng)形成的醛鍵斷裂，當分子間運動所產(chǎn)生的瞬間熱達到有效的溫度后，可促進甲醛固定后的蛋白變性[4]。微波輻射抗原修復(fù)法可迅速產(chǎn)生熱力，且容易操作，該方法也較為柔和，但是液體容易干涸，因而前期準備時需要足夠量的修復(fù)液，避免出現(xiàn)操作失誤。高壓抗原修復(fù)法主要利用高熱來促進醛鍵斷裂，當加上高壓閥加熱至沸騰，氣體噴出時的溫度可達到121 ℃左右，對一些較難修復(fù)的抗原修復(fù)效果較佳[5-6]。水浴法較為簡單，作用較為溫和，緩沖之后不易脫片，但是染色效果較差，顏色表現(xiàn)深淺不一，易產(chǎn)生假陰性，具有一定的局限性。

免疫染色是免疫組織化學(xué)技術(shù)最為關(guān)鍵的一步，在進行修復(fù)時標志物借助于熒光素、酶等標記抗體與組織切片或細胞涂片中相關(guān)的抗原結(jié)合，其中熒光素產(chǎn)生的熒光可用熒光顯微鏡觀察，而酶通過一定的顯色處理，呈現(xiàn)出醒目的陽性色彩，進而可較為準確地定位欲測定的抗原物質(zhì)，達到診斷、鑒別診斷和研究的目的。本研究采用高壓抗原修復(fù)法，CD4抗體陽性率為100.00%，而采用微波輻射修復(fù)法CD4抗體陽性率為49.47%，水浴修復(fù)法CD4抗體陽性率為43.16%，這3種方法對比，與微波輻射修復(fù)法、水浴修復(fù)法比，應(yīng)用高壓修復(fù)法CD4抗體陽性率較高。采用這3種方法時，CD8、Ki67、IL-17抗體陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且分析染色強度可見高壓修復(fù)法CD8、CD4、IL-17呈現(xiàn)的強陽性率高于微波輻射修復(fù)法、水浴修復(fù)法，由此可見高壓修復(fù)法下組織切片多呈均勻一致的強陽性，因而定位更為準確。綜合考慮，采用高壓抗原修復(fù)法的效果最佳。但是，利用高壓鍋修復(fù)時易產(chǎn)生劇烈運動，可導(dǎo)致標本出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，因此若3種修復(fù)方式抗體陽性率差異不大，也可選擇微波輻射修復(fù)法或水浴修復(fù)法。

綜上所述，采用高壓抗原修復(fù)法的總體效果優(yōu)于微波輻射修復(fù)法、水浴法修復(fù)，但由于實際運用時易導(dǎo)致脫片，因此在3種修復(fù)方式抗體陽性率差異不大的情況下，可選擇微波輻射修復(fù)法或水浴法修復(fù)法，臨床實際操作時需根據(jù)不同抗原修復(fù)特點選用合適的修復(fù)方法。