劉雷, 陳黎, 李華, 黃怡, 牟秋雨, 緱蕓莎, 李志鵬

1. 綿陽師范學院 森林與草原防災減災工程研究中心，四川 綿陽 621000；

2. 宜賓市產品質量監(jiān)督檢驗所，四川 宜賓 644000；

3. 綿陽師范學院 生命科學與技術學院，四川 綿陽 621000

大馬士革玫瑰（Rosa damasceneMiller）屬薔薇科、薔薇屬的植物，所產玫瑰精油純正、香氣濃郁、質量穩(wěn)定，符合ISO9842國際質量標準，是世界上最好的玫瑰精油生產品種之一，精油價格高于黃金數倍，被譽為“液體黃金”，在化妝品、食品、藥品及保健品等領域具有廣泛用途[1-2]。大馬士革Ⅲ玫瑰（Rosa damascene tyigintipetala）是從大馬士革玫瑰中、篩選所得優(yōu)良專用油用玫瑰品種，既具有大馬士革玫瑰的優(yōu)點，又具有抗病力強，適應性廣，產花量和出油率高的特點，廣泛用于栽培生產。關于大馬士革玫瑰，先前的研究主要集中在該品種的扦插育苗[3-5]、組培條件的篩選和優(yōu)化以及無性繁殖體系的建立[6-7]、揮發(fā)油的提取及組分的分離和鑒定[8-9]。

花青素是一類廣泛在于石竹類屬、大麗花屬、薔薇屬及金魚草屬等植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，具有抗氧化、抗突變等多種生物學功能，其中廣泛分布且常見的為6種，即天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素[10-11]?；ㄇ嗨卦谧匀唤缰兄饕蕴擒栈王；绞酱嬖?，不同的結合方式形成種類復雜、品種眾多的花色苷?；ㄉ憩F的生化機制是由于花瓣內細胞所含的類黃酮物質（花青素）、胡蘿卜素和生物堿的數量與含量的差異[12]。由于花色苷的種類眾多，要建立全部花色苷的檢測方法十分困難，但是將花色苷水解后形成花青素單體后，進行檢測，則變得簡單可行[13]。

大馬士革III玫瑰花青素種類和含量測定尚未有相關研究報的、呈色機理更是未知。本實驗采用鹽酸和甲醇作為溶劑超聲提取法對花青苷進行提取，沸水浴法對花青苷水解，高效液相色譜法對大馬士革III玫瑰蕾期、初開期、盛開期和盛開末期4個不同開花時期6種主要花青素（飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素、矮牽牛色素）種類及含量進行分析，擬建立大馬士革III玫瑰和其他植物源性主要花青素有效、穩(wěn)定的測定方法，分析大馬士革III玫瑰不同開花時期花青素的種類和含量，為大馬士革III玫瑰的呈色機理研究以及花色育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 260高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)，配二極管陣列檢測器（DAD）, Arium?comfort純水儀（德國賽多利斯集團）,電子分析天平(德國Sartorius bsa224s-cw型萬分之一)，KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，勻漿機（德國IKA公司），水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

飛燕草色素純物質Extrasynthese，矢車菊色素純物質Edqm，天竺葵色素純物質Extrasynthese，芍藥素純物質Extrasynthese，錦葵色素純物質ChromaDex，矮牽牛色素純物質Extrasynthese。甲醇（色譜純，北京迪科馬科技有限公司），甲酸、無水乙醇和鹽酸（分析純，成都市科龍化工試劑廠），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗材料

從四川省綿陽市游仙區(qū)柏林鎮(zhèn)萬山柏林玫瑰專業(yè)合作社取回的大馬士革III玫瑰材料，經綿陽師范學院生命科學與技術學院羅明華教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物大馬士革Ⅲ玫瑰（Rosa damascenetyigintipetala）。2017年 5月在晴天的上午，選取4個開花時期（蕾期、初開期、盛開期和盛開末期）的花蕾作為研究材料，來源于生長勢一致，花蕾均勻，花色一致的4年生植株的4個單株，每株分散選取10朵花，將每個單株10朵花的花瓣全部取下，3次生物學重復，用封口袋收集后放置冰盒中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 樣品制備

將200 g玫瑰花瓣樣品分次用勻漿機勻漿，勻漿后樣品在-18 ℃條件下保存。準確稱取1.000 0 g試樣至50 mL具塞比色管中，加入提取液（無水乙醇、水和鹽酸比例為2∶1∶1）定容至刻度，搖勻，靜置1 min，超聲提取30 min。超聲提取后，于沸水浴中水解1 h，冷卻至室溫，用提取液再次定容至50 mL。靜置后取上清液過0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液上機分析，用峰面積進行外標法定量。

2.2 單標儲備液制備

分別稱取一定質量飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素、矮牽牛色素標準品，用10%鹽酸甲醇溶液溶解定容，配制成0.5～1 mg/mL的單標儲備液，-18 ℃遮光保存。

2.3 混合標準工作液

把單標儲備液取用10%鹽酸甲醇溶液最終配制為50.0 mg·L-1的混合標準工作液。每次將此混合標準工作液稀釋成 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1的標準工作液，用于標準曲線的測定。

2.4 測定條件

色 譜 柱 ： Agilent ZORBAX SB-C18（ 5 μm）4.6 mm×250 mm；柱溫：35 ℃；流動相：1%甲酸水溶液：1%甲酸乙腈溶液，流速：0.8 mL·min-1；檢測器：DAD，波長：530 nm，進樣量：20.0 μL，水相濾膜0.45 μm。梯度洗脫條件見表1。

2.5 儀器檢出限、方法檢出限、定量限

色譜的儀器檢出限與儀器噪聲和標準曲線斜率有關，噪聲為峰高（LU），標準曲線為濃度和峰高的線性關系，具體公式如下：儀器檢出限=3×儀器噪聲÷標準曲線斜率；方法檢出限=儀器檢出限×50÷1.00（50：定容體積；1.00：稱樣量）；定量線=3×方法檢出限；利用2 mg/L的標準工作液色譜圖計算噪聲（ASTM），設定噪聲計算時間為8～10 min。利用標準工作液的峰高得到標準曲線y=Ax+B，其中y為響應值，x為濃度，A為標準曲線斜率，B為常數項。

表1 流動相梯度洗脫條件Tab. 1 Gradient elution conditions of the flow phase

2.6 線性關系考察

將0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1的標準工作液按 2.4 項的色譜條件測定飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素等6種花青素的峰面積。以標準品含量(mg·L-1)為橫坐標(x)，以峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線。

2.7 回收率及重復性試驗

回收率及重復性試驗：精密稱取空白樣品3份（已測定不含這6種花青素的玫瑰花），每份約1.00 g，按50 mg·kg-1的含量進行加標，按2.1項進行定量并計算加樣回收率。

2.8 樣品含量測定

取供試樣品適量，按上述方法測定不同開花時期大馬士革III玫瑰花中飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素等6種花青素的含量。

3 結果與分析

3.1 儀器檢出限、方法檢出限、定量限

稱樣量為1.000 0 g，定容體積為50 mL，飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素等6中花青素的方法檢出限為0.11、0.13、0.18、0.14、0.10 和 0.10 mg·kg-1；定量限為 0.33、0.39、0.57、0.42、0.30 和 0.30 mg·kg-1。

3.2 線性結果

按2.6的方法測試和計算得回歸方程如下：飛燕草色素：Y=99.27X-2.47（r=0.9998）；矢車菊色素：Y=125.78X-4.70（r=0.9998）；矮牽牛色素：Y=100.79X-3.78（r=0.9995）；天竺葵色素：Y=109.37X-1.10（ r=0.9999）； 芍 藥 素 ： Y=119.53X-2.09（ r=0.9999）；錦葵色素：Y=107.12X-3.19（r=0.9999）。以上結果表明，6種花青素的標準曲線線性均較好，能夠滿足測試需要。

3.3 回收率試驗及重復性試驗結果

回收率試驗結果見表2，6種花青素的加標回收率在63.8%～98.3%之間，平均加標回收率在64.2%～96.6%之間，加標回收的RSD分別為1.63%、1.87%、0.69%、0.34%、0.85%、0.56%，結果表明分析方法準確性良好。方法學考察結果表明該分析方法能夠滿足6種花青素的定量分析要求。

表2 6種花青素的加樣回收率Tab. 2 Recovery rate of 6 anthocyanins from samples

3.4 花青素的種類和含量

高效液相色譜法分析結果表明，大馬士革III玫瑰4個不同開花時期（蕾期、初開期、盛開期和盛開末期）可以檢測出常見6種花青素中的兩種，即矢車菊色素和天竺葵色素，而飛燕草色素、矮牽牛 色素、芍藥素和錦葵色素未能檢出（見表3）。

表3 不同開花時期大馬士革III玫瑰花青素組分含量方差分析結果Tab. 3 Variance analysis of anthocyanin contents from Rosa damascene tyigintipetala at different flowering periods

方差分析結果表明不同開花時期大馬士革III玫瑰矢車菊色素含量差異達到極顯著水平（P<0.01），且矢車菊色素由蕾期開始往后，其含量逐漸降低，LSD多重比較結果顯示，在4個不同開花時期矢車菊色素含量兩兩間差異均達到極顯著水平（P<0.01）。

天竺葵色素在初開期含量最高，蕾期和盛開期含量次之，盛開末期含量最低。方差分析結果表明不同開花時期大馬士革III玫瑰天竺葵色素含量差異達到極顯著水平（P<0.01），LSD多重比較結果表明，天竺葵色素在蕾期和初開期含量差異不顯著（P<0.01），與盛開期和盛開末期相比含量差異均達到極顯著水平（P<0.01），盛開期和盛開末期相比，天竺葵色素含量差異也達到極顯著水平（P<0.01）。

相關分析表明：檢測出來的兩種花青素（矢車菊色素、天竺葵色素）不同開花時期含量相關性不顯著。

4 討論與結論

4.1 HPLC法同時測定6種主要花青素方法的建立

目前，對植物花青素成分的提取的研究，主要采用甲醇熱回流法，該方法具有能耗大，效率低，耗時，提取溫度高等[14]；其次為酶解提取，該法價格昂貴，對pH值、溫度和作用時間等實驗條件要求高，可用于提取的梅種類不多，限制了該工藝的推廣和發(fā)展[15]。本試驗以植物源性食品中主要花青素成分（飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素）為指標成分，采用鹽酸和甲醇作為溶劑超聲提取的方法提取目標成分，超聲處理能夠加快花色苷的提取，使用強酸超聲提取后可直接進行水解，避免了萃取過程中的損失，目標成分的提取效率較高，分離度較好。六種主要花青素測定的線性范圍、線性相關系數、儀器檢出限、方法檢出限、定量限、精密度試驗RSD值、回收率試驗RSD值、重復性試驗RSD值等均達到測定標準要求。該方法簡便、快速、穩(wěn)定且重現性好，研究結果表明應用新建立的HPLC法，可以滿足大馬士革Ⅲ玫瑰樣品中和其他植物源性六類主要花青素成分分析測定要求。

4.2 花青素含量變化

本研究發(fā)現大馬士革Ⅲ玫瑰4個不同開花時期檢出了矢車菊色素和天竺葵色素兩種花青素，并且矢車菊色素含量在不同花期均占絕對優(yōu)勢，在開花過程中此兩類花青素含量均隨開花過程和花瓣褪色而降低，由此可以初步判定這兩種花青素相應的糖苷是決定大馬士革Ⅲ玫瑰花色的主要成分，開花過程中花色變化主要和矢車菊色素和天竺葵色素兩種花青素相應的糖苷含量變化相關。兩種花青素在初開期之前完成積累，隨著花朵開放不再合成，只是逐步降解?；ㄇ嘬针S花朵開放含量降低，可能是因為隨著花朵的開放，花瓣逐漸展開，花瓣受光面積增大，光照影響了花青苷的穩(wěn)定性，使其逐步降解，從而導致含量逐步降低。

4.3 花色育種

植物花色是觀賞植物重要的性狀之一，花色改良一直是園藝工作者重要的育種目標之一[16]。植物的花色不僅在吸引傳粉者、為植物的授粉和繁衍后代方面起到重要作用，也為植物提供了五色斑斕的色彩，具有重要美學價值[17-18]。月季（Rosa chinenis）、玫瑰（Rosa rugosa）和野薔薇（Rosa multiflora）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（RosaL.）的3個物種。與大馬士革Ⅲ玫瑰同屬的月季花色豐富，包括紅、朱紅、粉、橙白、藍紫、復色、混色各種色系，可以形成一個連接不斷的環(huán)形色譜圖，是開展花色研究的良好材料。相關的研究也表明，月季品種花青苷種類以天竺葵素和矢車菊素相應的糖苷為主，有些品種也富含芍藥素糖苷[19-20]，與本研究的結果一致。后續(xù)的研究將圍繞大馬士革Ⅲ及其相關近緣月季品種的花色表型及其色素分析開展，同時研究花青苷代謝途徑的分子調控機理，這些工作對于準確反映薔薇屬植物花色多樣性及花青苷的分布特點具有重要意義，同時也為探討大馬士革玫瑰花色的呈色機理和花色育種提供參考。