楊君，楚品品，宋帥，蔡汝健，楊冬霞，卞志標(biāo)，勾紅潮，李艷，蔣智勇，李春玲，閆鶴

（1華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣州 510640）

0 引言

【研究意義】副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）屬于巴斯德菌科、嗜血桿菌屬，短桿狀的革蘭氏陰性（G-）菌[1]。HPS感染者的癥狀是一系列炎癥反應(yīng)，如多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等[2-3]，使豬致病甚至死亡，死亡率可高達(dá) 50%[4]，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失?；谀壳暗难宸中头椒蓪PS分成15個血清型，其中5型最普遍且表現(xiàn)高毒力[5-8]，證實HPS的毒力因子有外膜蛋白（Omp）、莢膜多糖（Cps）、脂多糖（LPS）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、菌毛等[9]。LPS被證實是一種內(nèi)毒素，能致使機體發(fā)炎，嚴(yán)重時可導(dǎo)致敗血癥[10]。LPS結(jié)構(gòu)由三部分組成，即類脂A、核心多糖和O-抗原多糖[11-12]，HPS合成的LPS因缺少O-抗原多糖部分，也被稱為脂寡糖（LOS）[13]。而類脂A屬于LOS的活性部位，是以葡萄糖胺二糖為主體，上面含有多條?；?，lpxM基因編碼形成豆蔻酰酰基鏈的轉(zhuǎn)移酶，屬于其潛在的毒力因子。雖然目前對HPS的毒力基因有一些研究，但對于其致病機制研究的還不夠透徹，進(jìn)一步挖掘 HPS的毒力基因?qū)ι钊胙芯科渲虏C制進(jìn)而防控HPS感染具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ANDREY[14]等研究對鼠疫桿菌 lpxM 基因缺失對其毒力和疫苗潛力影響，該基因缺失后阻斷了其合成六?；念愔?A，在小鼠模型中驗證毒力和疫苗保護(hù)效力時發(fā)現(xiàn)，缺失株的LD50無變化，但其毒力有2.5—1.6倍的降低，免疫保護(hù)效力有明顯提高。HAUTEVILLE[15]等發(fā)現(xiàn)弗氏志賀菌的兩個 msbB（lpxM）基因?qū)ζ浣閷?dǎo)的炎癥反應(yīng)和破壞腸道的上皮細(xì)胞具有重要作用，將該基因鈍化后能減少刺激人單核細(xì)胞TNF-α的分泌和削弱對上皮屏障的炎癥破壞作用。XU[16]等研究了lpxM基因?qū)η葜虏⌒源竽c桿菌毒力等一些生物學(xué)特性的影響，結(jié)果lpxM缺失對生長速率和對抗雞血清殺菌能力無影響，但對雞巨噬細(xì)胞系的入侵及存活能力顯著降低，動物試驗中也發(fā)現(xiàn)了缺失對動物器官的入侵能力降低，以上結(jié)果表明 lpxM 基因?qū)?xì)胞的毒力及其它生物活性具有一定的影響。目前，對HPS的LOS合成相關(guān)基因研究有很多，包括多糖合成相關(guān)基因galU和galE[4]、rfaD和rfaF[17]、lgtB和lex-1[13]、lgtF[18]、rfaE[19]等，這些基因的缺失對HPS的毒力、生長、生物被膜形成、血清抗性及對細(xì)胞的炎癥作用具有一定的影響。上述研究為lpxM基因缺失對HPS生物學(xué)功能影響奠定了基礎(chǔ)。【本研究切入點】雖然 lpxM 基因在對多數(shù)G-菌生物學(xué)特性特別是毒力具有一定影響，但該基因?qū)PS影響的研究未見報道，lpxM基因?qū)PS的生長、毒力等生物學(xué)特性的影響還未知，故需要對此展開研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】驗證 lpxM 基因缺失對HPS的生長情況，生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力、對RAW264.7細(xì)胞毒力及對臨床上常用的13種抗生素和多粘菌素B敏感性部分生物學(xué)特性的影響，為研究lpxM基因的功能，揭示HPS的致病機制及開發(fā)HPS的基因工程弱毒疫苗奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和載體

5型地方分離株副豬嗜血桿菌H45由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室分離保存；大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國生物科技有限公司；RAW264.7細(xì)胞、自殺載體PK18mobsacB和輔助質(zhì)粒 pCas由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室保存。本研究于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所2019年上半年完成。

1.2 試劑、培養(yǎng)基和試劑盒

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基和結(jié)晶紫購至廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2×TaqPCRMaster Mix、T4DNA連接酶、DNA限制性核酸內(nèi)切酶購于大連寶生物工程有限公司；卡那霉素（KanR）購自北京鼎國生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒及純化試劑盒購自美國OMEGA公司；細(xì)胞毒性LDH檢測試劑盒購自美國Promega公司；抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物

本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.4 副豬嗜血桿菌缺失株的構(gòu)建與鑒定

1.4.1 重組片段的制備 以副豬嗜血桿菌 SH0165（GenBank登錄CP001321.1）在NCBI上公布基因序列為參考，設(shè)計 lpxM基因上下游同源臂引物，并在上下游同源臂加上酶切位點和USS序列，以H45基因組為模板通過 PCR擴增上下游同源臂片段，質(zhì)粒pCas為模板擴增卡那抗性表達(dá)盒，以這3個片段為模板通過重疊延伸PCR得到同源重組片段M-UKD。

1.4.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將同源重組片段 M-UKD和載體PK18mobsacB雙酶切，純化后用T4DNA連接酶過夜連接。將連接好的質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有卡那霉素抗性平板的TSA平板（50ng·μL-1，下同）上，PCR和雙酶切測序鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.4.3 自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建缺失株 利用構(gòu)建好的重組質(zhì)粒PKM-UKD自然轉(zhuǎn)化進(jìn)H45構(gòu)建lpxM基因缺失株，轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[4, 20-21]中構(gòu)建HPS自然轉(zhuǎn)化法。其步驟大致如下：將轉(zhuǎn)化用的受體菌H45接種于TSA（含10%新鮮牛血清和0.1% NAD，下同）平板活化，37℃恒溫烘箱過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌用3 mL TSB洗下，調(diào)整其OD600為0.9—1.0。取20 μL菌液于 1.5 mL EP 管中，加入 20 μL cAMP(8 mmol·L-1)作用10 min，然后加10 μL（約1μg）質(zhì)粒，混勻后作用10 min；同時以10 μL無菌水與細(xì)菌混勻，作為陰性對照。把作用后的菌與質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)移到TSA平板上，直徑約1 cm，平皿正置于37℃培養(yǎng)5 h后用200 μL TSB洗滌菌體并涂布于含卡那霉素的TSA抗性平板上，37℃倒置培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子，PCR鑒別是否發(fā)生了 lpxM基因的缺失。

1.5 缺失株與野生株生長情況比較

挑取活化的基因缺失株 H45-△lpxM和野生株H45于5 mL含相應(yīng)抗性的TSB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)12 h左右，利用紫外分光光度計調(diào)節(jié)兩株菌的OD600值保持一致；按1﹕100的比例轉(zhuǎn)接至200 mL含相應(yīng)抗性的TSB培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)16 h，每間隔1 h測定其OD600值，繪制時間t-OD600的曲線。

1.6 缺失株與野生株生物被膜形成能力比較

生物被膜形成能力比較參考文獻(xiàn)[1, 4]，做一定修改。準(zhǔn)備潔凈玻璃試管分成3組，1組空白組和2組試驗組，每組3根試管，每支玻璃試管中加入 3 mL TSB，試驗組中每個試管中各加入60μL的H45或H45-△lpxM，空白組只加培養(yǎng)基，將試管靜置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24h，移除菌液并用蒸餾水輕輕沖掉游離菌體，室溫下用3 mL 1%的結(jié)晶紫溶液染色5—10 min后用流水輕緩沖洗至少3次，至沖洗液變?yōu)闊o色為止，將試管倒置晾干后觀察結(jié)果（拍照），每根試管用1 mL 33%（v/v）醋酸溶解，并630 nm波長下測定吸光度。

2003 年，Cousin 等[9]將 ASCs 注入骨髓功能缺失的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其造血及淋巴系細(xì)胞的生成得以恢復(fù)，并在體外實驗中促進(jìn)髓系細(xì)胞分化。此后，大量研究證實 ASCs 主要通過細(xì)胞間接觸作用于多種免疫細(xì)胞并調(diào)控免疫分子，發(fā)揮復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)功能并總體起到劑量依賴的免疫抑制作用 [10]。

1.7 缺失株與野生株抗血清殺菌能力比較

抗血清殺菌試驗參考文獻(xiàn)[22]，方法如下：血清來源于3—4周齡未感染HPS的健康小豬，血清過0.22 μm濾膜除菌，置于-80℃保存。取部分血清于56℃水浴鍋滅活補體30 min，得到滅活血清。取100 μL滅活或沒滅活血清分別與 100 μL 菌液（107—108cfu·mL-1）混合（菌液﹕血清=1﹕1），37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，梯度稀釋涂布平板進(jìn)行計數(shù)，每個樣本設(shè)置3個平行。

1.8 缺失株與野生株對RAW264.7細(xì)胞毒性比較

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)至良好狀態(tài)后轉(zhuǎn)移到96孔板中（105Cells/孔）培養(yǎng)過夜，第二天分別用H45或H45-△lpxM（MOI=10， 106cfu/孔）刺激，不加菌作為陰性對照，作用時間為6、12和24 h，每個時間點收取細(xì)胞上清液并使用 LDH檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性檢驗，每組做3個平行。

1.9 缺失株和野生株對抗生素敏感性比較

使用 Kirby-Bauer 紙片擴散法（K-B法）進(jìn)行抗生素敏感性試驗[23-24]。本試驗使用的抗生素為臨床上常用的13種抗生素及多粘菌素B，分別為氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢噻肟、慶大霉素、多西環(huán)素、磺胺二甲異噁唑、氟苯尼考、阿莫西林、恩諾沙星。實驗步驟為，菌液復(fù)蘇和傳代，涂板、貼藥敏片，37℃倒置18—24 h，讀取抑菌圈直徑，每個藥敏片做3個平行，耐藥結(jié)果根據(jù)藥敏標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

Word和 Excel軟件用于數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計以及作圖，統(tǒng)計學(xué)分析和作圖使用GraphPad Prism 7。

2 結(jié)果

2.1 重組片段的擴增

以H45基因組為模板，PCR擴增lpxM基因上游同源臂（489 bp）、下游同源臂（593 bp），以pCas為模板，PCR擴增卡那抗性表達(dá)盒（909 bp），重疊延伸PCR將上游、卡那抗性表達(dá)盒、下游同源臂連接得到重組片段M-UKD（1 991 bp，圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將 M-UKD和 PK18mobsacB雙酶切后過夜連接，轉(zhuǎn)化 DH5α，挑取抗性平板上長出的單菌落搖菌，小提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到1 991 bp的重組片段M-UKD和5 719 bp的載體片段（圖2），將酶切的片段進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與目的序列進(jìn)行比對無誤后確定 lpxM 基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為PKM-UD。

圖1 重組片段的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant fragments

圖2 重組質(zhì)粒PKM-UKD雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid PKM-UKD by double enzyme digestion

2.3 缺失株的鑒定

利用 3對引物對抗性平板上長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒為陽性對照，鑒別其是否發(fā)生了目的片段的缺失（圖 3）。第 1對引物lpxM-up-EcoRI-F/lpxM-down-PstI-R進(jìn)行擴增，H45擴增得到1 622 bp的條帶，H45-△lpxM擴增得到1 991 bp的條帶，說明909 bp的卡那抗性表達(dá)盒替代了lpxM基因的540 bp部分片段，H45發(fā)生了lpxM基因部分片段的缺失；第2對引物kanR-F/R擴增，H45擴增不到條帶，而H45-△lpxM擴增得到909 bp的條帶，說明卡那抗性表達(dá)盒整合到染色體上；第 3對引物sacB-F/R進(jìn)行鑒定，兩者均不能擴增到條帶，說明質(zhì)粒在缺失株內(nèi)發(fā)生消除。最后，用引物HPS-F/R鑒定該缺失株是否為HPS，結(jié)果顯示可擴到條帶（圖4），說明在卡那抗性平板上長出的轉(zhuǎn)化子是HPS。結(jié)果表明關(guān)于H45的lpxM基因部分片段缺失的缺失株H45-△lpxM已經(jīng)構(gòu)建成功。

圖3 lpxM基因缺失株的鑒定Fig.3 Identification of the lpxM gene deletion strain

2.4 lpxM基因缺失對HPS生長的影響

2.5 lpxM基因缺失對HPS生物被膜形成的影響

圖4 鑒定是否為HPSFig.4 Identification of the HPS

圖5 野生株和缺失株的生長曲線Fig.5 Growth curves of wild and deletion strains

生物被膜形成能力的結(jié)果如圖6，從左到右依次是H45、H45-△lpxM和空白對照靜置培養(yǎng)24 h后生物被膜產(chǎn)生的情況，圖6中顯示缺失株產(chǎn)生的生物被膜弱于野生株H45。測定OD630值（圖7），H45的OD630值為0.237，而H45-△lpxM只有0.173，說明lpxM基因的缺失使得H45生物被膜形成的能力減弱。

2.6 lpxM基因缺失對HPS血清抗性的影響

如圖 8，H45在缺失 lpxM基因后在 50%的豬血清中存活能力顯著降低，由16.1%降到了0.71%，說明缺失該基因后導(dǎo)致 H45抵抗血清補體殺菌能力降低，lpxM基因可能與HPS抗血清殺菌的能力相關(guān)。

2.7 lpxM基因缺失對HPS致細(xì)胞毒性的影響

結(jié)果如圖9，H45和H45-△lpxM刺激RAW264.7細(xì)胞后均能引起細(xì)胞死亡，作用時間為6、12和24 h，H45對細(xì)胞的致死率分別為 6.63%、10.86%和22.17%，H45-△lpxM對細(xì)胞的致死率分別為2.62%、6.35%和18.01%，隨著作用時間的延長，兩者對細(xì)胞毒性越來越大，但在3個時間點H45-△lpxM對細(xì)胞的毒性均低于H45，說明lpxM基因可能與HPS毒力相關(guān)。

圖6 生物被膜形成Fig.6 Biofilm formation

圖7 生物被膜OD630值Fig.7 Biofilm OD630 value

圖8 血清存活能力Fig.8 Survival of HPS treated with porcine serum

圖9 細(xì)胞毒性試驗Fig.9 Cell cytotoxicity test

2.8 lpxM基因缺失對抗生素敏感性影響

H45和H45-△lpxM對13種臨床上常用抗生素和多粘菌素B的藥敏結(jié)果如表2，兩者均對頭孢噻吩等10種抗生素和多粘菌素B表現(xiàn)敏感，但是抑菌圈直徑存在一定的差異，大多數(shù)抗生素后者的抑菌圈要大于前者，說明后者對抗生素的敏感性更高，對氨芐西林、阿莫西林克拉維酸和磺胺二甲異噁唑這 3種抗生素，兩者的敏感性有較大差異，缺失lpxM基因后，菌株對氨芐西林的耐藥性由中介（I）變成敏感（S），對阿莫西林克拉維酸和磺胺二甲異噁唑由耐藥（R）變成了敏感（S），說明lpxM基因?qū)45的抗生素耐藥性具有一定的影響，但具體機制還需要進(jìn)一步研究。

表2 藥物敏感性結(jié)果（抑菌圈直徑mm）Table 2 Results of drug sensitivity (antimicrobial zone diameter mm)

3 討論

血清5型的HPS屬于強毒株，能引起豬產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)甚至死亡。LOS是 HPS的一個毒力因子，而類脂 A是 LPS活性部位，其結(jié)構(gòu)影響著LOS的毒力[13]。類脂A是以葡萄糖胺二糖為主體，含有多條?；満土姿峄鶊F(tuán)，而 lpxM基因編碼的酰基轉(zhuǎn)移酶LpxM負(fù)責(zé)類脂A合成的最后一步，即將豆蔻酰（C14）?；溸B接到葡萄糖胺二糖 3′-位點上，得到完整結(jié)構(gòu)的類脂A[16,25]。類脂A上酰基鏈的數(shù)量影響LOS的結(jié)構(gòu)，繼而影響其毒力。本研究以自殺性質(zhì)粒 PK18mobsacB為載體構(gòu)建了關(guān)于lpxM基因缺失的重組質(zhì)粒，通過將重組質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化進(jìn)HPS得到基因缺失株，繼而比較了缺失株和野生株的生長情況、生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力、對RAW264.7細(xì)胞毒力作用和對部分抗生素的敏感性。

通過生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)8 h前缺失株生長速度明顯慢于野生株，7 h時野生株的OD600為0.8223，H45-△lpxM只有0.5473，8 h之后野生株和缺失株生長情況達(dá)到一致。前期明顯慢于野生株，后期達(dá)到一致，說明lpxM基因的缺失對H45的生長情況具有一定影響，該基因的缺失影響 LOS合成繼而導(dǎo)致 HPS生長變慢，這也與大腸桿菌 lpxM 基因缺失后生長情況變化情況一致[25]。

生物被膜形成的能力能反映菌株毒力，生物被膜產(chǎn)生能力越強可認(rèn)為菌株毒力越強，生物被膜能幫助細(xì)菌抵御不良的環(huán)境的危害，使其逃逸于宿主的免疫系統(tǒng)和抗生素的作用，最終導(dǎo)致其抵抗能力增強[26]。目前的研究證明影響 HPS生物被膜形成能力的基因有vacJ[27]、galU和galE[4]等，本研究首次證實lpxM基因與HPS生物被膜形成的能力相關(guān)，該基因的缺失導(dǎo)致能力減弱。

血清抗性在HPS先天性免疫防御中發(fā)揮巨大作用，被認(rèn)為是HPS的一個毒力機制，LOS和多糖的合成蛋白CapD參與其對血清補體的抗性[28-29]。根據(jù)之前的研究證實 HPS的lgtB和lex-1[13]、galU和galE[4]等基因?qū)ζ淇寡鍤⒕哂幸欢ㄓ绊?，本研究也初步證實lpxM基因?qū)PS在50%豬血清中的抗性具有一定影響，該基因缺失能降低其在血清中的存活能力。

細(xì)胞毒性可能不是 HPS用來增加血腦屏障通透性的機制，HPS和其分泌的 LOS均不能對豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PBMEC）產(chǎn)生毒力[30-31]。而本研究結(jié)果表明HPS對RAW264.7細(xì)胞具有一定的毒力，并且缺失LOS合成的相關(guān)基因lpxM后，對細(xì)胞的毒力降低，說明LOS合成的相關(guān)基因lpxM對 HPS的毒力具有一定影響，但具體機制還需要進(jìn)一步研究。

lpxM基因是關(guān)于類脂A合成的最后一步基因，而類脂A是細(xì)胞膜的主要組成部分，多粘菌素B的作用機制是破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)[25]。HPS防治的過程使用大量抗生素，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生。本研究展示lpxM基因缺失對臨床上常用的13種抗生素和多粘菌素B的影響，缺失該基因?qū)Ω鞣N抗生素敏感性提高，部分抗生素從耐藥變成敏感，結(jié)果與文獻(xiàn)[16, 25]中l(wèi)pxM 基因缺失導(dǎo)致大腸桿菌對一些抗生素敏感性提高的結(jié)果一致，說明 lpxM 基因可能與菌株對部分抗生素的敏感性相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建HPS的5型地方分離株H45的lpxM 基因缺失株，通過部分生物學(xué)特性比較結(jié)果顯示，lpxM基因缺失對 HPS 生長速度具有一定影響，生長前期抑制其生長，降低其生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力和對RAW264.7細(xì)胞毒力，提高對氨芐西林等多種臨床上常用抗生素和多粘菌素 B的敏感性，對少量的抗生素敏感性甚至發(fā)生變化，從耐藥變成敏感，這些研究結(jié)果對進(jìn)一步探究 lpxM 基因功能及揭示 HPS的致病機制和相關(guān)基因的弱毒疫苗開發(fā)提供一定的科學(xué)試驗依據(jù)。