李孝鵬 王章桂 魏 南

2018年世界腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：全世界新發(fā)腫瘤人數(shù)為1 810萬(wàn)，死亡人數(shù)為960萬(wàn)[1]，放療是腫瘤主要治療手段之一，放射線對(duì)腫瘤周圍正常組織損傷是引起放療副反應(yīng)的重要基礎(chǔ)，阿米福汀(amifostine,WR-2721)作為輻射保護(hù)劑，具有清除自由基、轉(zhuǎn)移氫離子和穩(wěn)定DNA的作用，放療前15分鐘使用WR-2721，可以降低放射線引起的腫瘤周圍正常組織損傷[2]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸脂(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是綠茶的主要活性成分，具有清除自由基，降低輻射引起的正常組織損傷，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性[3]。卵巢對(duì)放射線非常敏感，即使接受<2 Gy X線照射，也會(huì)導(dǎo)致50%的卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，6 Gy X線照射可引起30歲女性卵巢中度功能障礙，隨著照射劑量的繼續(xù)增加，可引起急性卵巢功能衰竭、不孕、絕經(jīng)[4]，絕經(jīng)前婦女放療時(shí)，須注意卵巢的輻射保護(hù)。本研究探討EGCG在輻射引起的小鼠卵巢損傷中的作用，明確聯(lián)合WR-2721在輻射損傷中的意義，為探索新型輻射保護(hù)劑提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SPF級(jí)6～8周ICR小鼠150只，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(皖)2017-0012],體質(zhì)量24.12～31.77 g，平均(28.07±2.02)g，飼養(yǎng)室溫度20℃，相對(duì)濕度50%，充足的食物及水供應(yīng)。

1.1.2 藥品及試劑 EGCG(每瓶0.5 g，批號(hào)E8307，南京道斯夫生物技術(shù)有限公司)；WR-2721(每瓶0.4 g，批號(hào)H20010403，大連美羅大藥廠)；注射用孕馬血清促性腺激素(每瓶1 000 IU，批號(hào) S160907，寧波三生藥業(yè)有限公司)；TUNLE試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.1.3 儀器 Precise直線加速器(瑞典醫(yī)科達(dá)公司)；BC-5300血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞公司)；DMD108顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)；BT25S分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 動(dòng)物分組、模型建立及標(biāo)本采集

1.2.1 動(dòng)物分組 小鼠編號(hào)后，按照隨機(jī)數(shù)字法分為Sham組(不接受輻射)、Control組(接受輻射，不接受WR-2721或EGCG治療)、WR組(接受輻射和WR-2721治療)、EGCC組(接受輻射和EGCG治療)和WR+EGCG組(接受輻射以及WR-2721和EGCG聯(lián)合治療)，每組30只。

1.2.2 模型建立 輻射前48小時(shí)，所有小鼠腹腔注射5 IU孕馬血清促性腺激素，統(tǒng)一動(dòng)情周期；輻射前2小時(shí)，將EGCG(40 mg/kg)經(jīng)口服給藥方式給相應(yīng)組別的小鼠；輻射前15分鐘，將WR-2721 (300 mg/kg)經(jīng)腹腔注射方式給相應(yīng)組別的小鼠；輻射方法：小鼠固定在特制的盒子內(nèi)接受6 Gy X線照射，劑量率為600 cGy/min，放射源到小鼠的距離為100 cm。

1.2.3 標(biāo)本采集 輻射后第8小時(shí)、第3、7、10、14天測(cè)小鼠體質(zhì)量，第8小時(shí)、第7天和第14天處死小鼠，每次每組10只小鼠禁食、禁水6 h，腹腔注射10%的水合氯醛(4 mL/kg),麻醉后摘除眼球取20 μL的血液，放入含EDTA-K2抗凝劑的離心管；取小鼠雙側(cè)卵巢，稱重后，一側(cè)置于4%甲醛溶液中，另一側(cè)置于RNA保護(hù)液中，計(jì)算卵巢指數(shù)[卵巢指數(shù)=卵巢質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%]。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 一般情況觀察 每2天稱小鼠體質(zhì)量1次，觀察并記錄其體質(zhì)量變化、飲食情況、毛色、精神狀態(tài)等。

1.3.2 血細(xì)胞測(cè)定 用血細(xì)胞分析儀測(cè)定各組小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)。

1.3.3 卵巢病理學(xué)檢查 小鼠卵巢經(jīng)4%甲醛溶液充分固定后，分別以70%、80%、90%、95%、100%濃度的乙醇對(duì)組織進(jìn)行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片后，將切片放在二甲苯中脫蠟20 min，然后在100%、95%、90%和80%乙醇各浸1 min，HE染色。在光學(xué)顯微鏡下，觀察卵巢組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 細(xì)胞凋亡及凋亡指數(shù)檢測(cè) 采用TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)卵巢細(xì)胞凋亡,每組隨機(jī)選取3只小鼠，共200個(gè)卵泡，卵泡中30%的顆粒細(xì)胞染色呈陽(yáng)性時(shí)，判定該卵泡凋亡[5]。凋亡指數(shù)為卵泡中染色陽(yáng)性顆粒細(xì)胞數(shù)占顆粒細(xì)胞總數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

2.1 輻射后體質(zhì)量和血象變化 小鼠體質(zhì)量存在組別和時(shí)間點(diǎn)的交互作用，Control組小鼠輻射后第7天，體質(zhì)量顯著下降，后緩慢恢復(fù)。Sham組小鼠體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，WR、EGCG、WR+EGCG組小鼠輻射后，體質(zhì)量緩慢上升，不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量小鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；WR、EGCG組小鼠體質(zhì)量與Control組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，WR+EGCG組與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞存在組別和時(shí)間點(diǎn)的交互作用，與Sham組比較，輻射后小鼠白細(xì)胞數(shù)均降低,Control組下降幅度最顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2；輻射后第14天，WR、EGCG、WR+EGCG組紅細(xì)胞數(shù)均高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3；各組血紅蛋白水平輻射后變化不大，見(jiàn)表4；輻射后第7天，與WR+EGCG組相比，Control組小鼠血小板計(jì)數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表2 5組小鼠白細(xì)胞變化比較

表3 5組小鼠紅細(xì)胞變化比較

表4 5組小鼠血紅蛋白比較

表5 5組小鼠血小板比較

2.2 卵巢形態(tài)及卵巢指數(shù)變化 輻射后8小時(shí)，Sham組、Control組和WR+EGCG組卵泡形態(tài)無(wú)明顯差異。輻射后第7、14天，與Sham組相比，Control組的卵泡平均數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)大量閉鎖卵泡或空卵泡，WR、EGCG組存在少量的閉鎖卵泡或空卵泡，而WR+EGCG組未見(jiàn)閉鎖卵泡或空卵泡。見(jiàn)圖1。

圖1 輻射后小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)比較(指向三級(jí)卵泡,表示閉鎖卵泡,CL為黃體)(HE,×40)

小鼠卵巢指數(shù)存在組別和時(shí)間點(diǎn)的交互作用，進(jìn)一步按時(shí)間點(diǎn)分層比較，輻射后8小時(shí)，5組小鼠的卵巢指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。輻射后第7天，與Sham組及WR+EGCG組相比，Control組小鼠卵巢指數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，WR、EGCG及WR+EGCG組小鼠卵巢指數(shù)輕度下降，且3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。輻射后第14天，EGCG組及WR+EGCG組小鼠卵巢指數(shù)高于Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 5組小鼠卵巢指數(shù)比較

2.3 卵巢細(xì)胞凋亡變化 所有組別中，Control組TUNEL染色陽(yáng)性的閉鎖卵泡及凋亡顆粒細(xì)胞最多。見(jiàn)圖2。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)存在組別和時(shí)間點(diǎn)的交互作用，與Sham組比較，接受輻射的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)均升高，Control組最高,EGCG組和WR組凋亡指數(shù)升高介于Control組及WR+EGCG組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表7。

圖2 卵巢組織陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色，固縮成團(tuán)或聚成環(huán)狀，或碎裂，形成凋亡小體(IHC,×100)

表7 5組小鼠卵巢凋亡指數(shù)比較

3 討論

既往研究[5-6]表明接受大劑量輻射后，小鼠出現(xiàn)煩躁不安，反應(yīng)遲鈍，飲食量下降，體質(zhì)量減輕等改變。骨髓及造血系統(tǒng)嚴(yán)重破壞，表現(xiàn)為骨髓細(xì)胞大量死亡，有核細(xì)胞及造血干細(xì)胞急劇減少，外周血細(xì)胞減少，尤其是白細(xì)胞，對(duì)血小板及紅細(xì)胞影響稍小。本研究結(jié)果顯示，接受輻射后第7天，Control組小鼠體質(zhì)量降至最低點(diǎn)，后緩慢恢復(fù)，WR、EGCG及WR+EGCG組小鼠體質(zhì)量未見(jiàn)降低，但增長(zhǎng)幅度變緩，輻射對(duì)WR+EGCG組小鼠體質(zhì)量影響最小。輻射可致外周血中白細(xì)胞降低，對(duì)血小板、紅細(xì)胞及血紅蛋白影響較小，WR-2721和EGCG能降低輻射后外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)下降程度，聯(lián)合用藥對(duì)外周血細(xì)胞保護(hù)作用更顯著。因此，EGCG聯(lián)合WR-2721可預(yù)防小鼠輻射后體質(zhì)量下降，降低放射線對(duì)骨髓的損傷，維持血細(xì)胞水平。

卵巢由卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞組成，顆粒細(xì)胞圍繞著卵母細(xì)胞形成一個(gè)功能性的卵泡單元，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，卵巢極易受到輻射損傷，電離輻射暴露后數(shù)小時(shí)，分裂的顆粒細(xì)胞功能最早受到影響，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間雙向調(diào)節(jié)減少，卵泡發(fā)育受到損傷，導(dǎo)致卵巢早衰和不孕，卵母細(xì)胞的遺傳DNA也可能被破壞，并傳遞給子代。不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞對(duì)輻射損傷的敏感性不同，靜止的原始卵泡抗輻射能力最強(qiáng)，成熟的竇狀卵泡對(duì)輻射最敏感。輻射還會(huì)引起卵巢血管基質(zhì)萎縮和纖維化，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡和卵泡閉鎖[7-9]。本研究中，小鼠接受輻射后，不同發(fā)育階段的卵泡顯示出明顯的變形，晚期閉鎖卵泡顆粒層附近空腔內(nèi)可見(jiàn)核固縮和凋亡細(xì)胞碎片，閉鎖卵泡數(shù)量顯著增加。輻射后第7天，小鼠卵巢凋亡顆粒細(xì)胞數(shù)量多于第8小時(shí)的數(shù)量，具有閉鎖特征。Control組小鼠卵巢凋亡指數(shù)升高，WR、EGCG及WR+EGCG組凋亡指數(shù)也升高，但均低于對(duì)照組，尤其是WR+EGCG組。Control組小鼠卵巢指數(shù)下降，WR、EGCG及WR+EGCG組卵巢指數(shù)輕度下降，WR+EGCG組小鼠指數(shù)下降幅度最低。因此，WR-2721、EGCG可協(xié)同逆轉(zhuǎn)輻射引起的顆粒細(xì)胞凋亡作用。

WR-2721進(jìn)入體內(nèi)后生成具有活性的硫醇自由基和WR-1065，可清除放療過(guò)程中組織產(chǎn)生的自由基，以P53依賴的方式保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒效應(yīng)，與DNA核蛋白結(jié)合后，改變?nèi)旧w核小體間的結(jié)構(gòu)，降低細(xì)胞凋亡。WR-2721半衰期約30 min，部分患者使用后，可出現(xiàn)為頭暈、惡心、嘔吐、乏力等癥狀[10]。EGCG使用方便且基本沒(méi)有副反應(yīng)，Ⅱ～Ⅲ期臨床研究[3,11]表明，肺癌、食管癌放化療期間每日口服EGCG能明顯降低放射性食管炎發(fā)生率，且服用時(shí)間越早，效果越好，對(duì)出現(xiàn)的放射性食管炎治療效果確切。放射性食管炎作用機(jī)制可能為：①EGCG能降低血清丙二醛水平，提高血清總超氧化物歧化酶活力，上調(diào)Nrf2-ARE信號(hào)途徑增加抗氧化酶表達(dá)，提高機(jī)體抗氧化能力[12]；②放療引起組織DNA Rad23b和Ddit3啟動(dòng)子高甲基化和表達(dá)降低來(lái)逆轉(zhuǎn)輻射損傷[13]；③通過(guò)清除過(guò)多的活性氧或促進(jìn)已發(fā)生轉(zhuǎn)化的異常細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，EGCG可以降低輻射后卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，減少卵巢閉鎖，保護(hù)卵巢形態(tài)與功能，作用機(jī)制與WR-2721不同，兩者聯(lián)合使用對(duì)輻射后的卵巢保護(hù)作用更顯著，且EGCG為綠茶提取物，安全性更高。