王其霖，王珊，李港，毛傳樨，金珊

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

微管是一種具有極性的細(xì)胞骨架，為長管狀的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)輸送等過程中起著重要作用[1]. 微管是由α，β兩種類型的微管蛋白亞基形成的微管蛋白異二聚體和少量的微管結(jié)合蛋白(microtubule associated proteins，MAPs)聚合而成. 在微管動態(tài)變化過程中，有兩類蛋白參與微管組裝和解聚的動態(tài)調(diào)節(jié)[2]. 其中一類是微管穩(wěn)定因子，包括多種微管結(jié)合蛋白MAPs(如Tau、MAP 1和MAP 4)和微管末端協(xié)助微管聚合的因子(如EB 1和CLIP 170)等. 另一類是微管去組裝因子，參與微管剪切和末端解聚，如Fidgetin、Kinesin、Spastin及Katanin等. 某一蛋白的編碼基因發(fā)生突變時能夠?qū)е履承┻z傳性疾病的發(fā)生，如spastin突變時可以導(dǎo)致遺傳性痙攣性截癱[3]；TUBB3 (β-tubulin isotype III)突變可以導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病TUBB綜合癥[4]；微管結(jié)合蛋白Tau的異常磷酸化可以導(dǎo)致阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)[5].

Fidgetin是AAA(ATPase associated with various cellular activities)超家族成員之一，與Katanin及Spastin同屬于微管剪切蛋白[6].Fidgetin可以在紡錘體的負(fù)端剪切微管使其解聚而破壞微管的動態(tài)平衡[6]. 該蛋白至少有兩個重要的結(jié)構(gòu)功能域，一個是具有ATP酶活性的可以剪切微管的AAA區(qū)結(jié)構(gòu)域(ATPase associated with various cellular activities domain, AAA domain)，另一個是具有α螺旋結(jié)構(gòu)，對ATP酶起調(diào)節(jié)作用的Vps4(vacuolar protein sorting 4，Vps4)碳端區(qū)域[7-8]. 從細(xì)菌到脊椎動物人類中均有fidgetin的同源基因存在，僅在脊椎動物中存在3個fidgetin同源基因，分別為fidgetin、fidgetinlike1(fidl-1)及fidgetinlike2(fidl-2).果蠅中Fidgetin與脊椎動物的Fidgetin like 1一致性最高. Yang的體外實驗顯示在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有Fidgetin like 1分布，而Fidgetin及Fidgetin like 2主要分布于細(xì)胞核中[9]. 小鼠的fidgetin發(fā)生突變會導(dǎo)致其耳蝸半規(guī)管缺失，而半規(guī)管的減少或缺失會導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)左右搖頭的行為，突變小鼠還出現(xiàn)了小眼表型，這可能與細(xì)胞周期延遲和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細(xì)胞生長不良有關(guān)，以及少量骨骼異常如：顱骨融合、骨盆帶發(fā)育不全和多指畸形等現(xiàn)象[10].Fidgetinlike1的表達(dá)水平受成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)及轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的抑制，當(dāng)在MC3T3-E1細(xì)胞中加入FGF及TGF-β1后fidgetinlike1表達(dá)明顯下調(diào)[11].在秀麗隱桿線蟲中(Caenorhabditiselegans,C.elegans)fidgetinlike1的同源基因是MEI-1，當(dāng)其發(fā)生突變時，導(dǎo)致生殖干細(xì)胞停滯于有絲分裂期而導(dǎo)致線蟲不育[12]. 微管剪切蛋白Spastin突變導(dǎo)致的遺傳性痙攣性截癱[3]，最近新發(fā)現(xiàn)的Paget骨病也是由一種AAA蛋白VCP/p95突變引起的.Fidgetin是第一個被報道的與發(fā)育相關(guān)的AAA蛋白家族成員[10]. 到目前為止其體內(nèi)功能尚不明確，特別是對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響幾乎是個空白.

Fidgetin位于果蠅二號染色體的長臂的23E3區(qū)，它編碼的蛋白質(zhì)與人類Fidgetin like 1同源性最高，一致性(identity)為30%，相似性(similarity)為48%，與Fidgetin like 2同源性最低(圖1). 在過去的數(shù)年中，對fidgetin功能的研究主要集中在體外培養(yǎng)細(xì)胞、線蟲及小鼠組織結(jié)構(gòu)上，體外高表達(dá)fidgetin可以完全破壞培養(yǎng)細(xì)胞的微管網(wǎng)絡(luò)，使微管完全消失[13]. Cox等研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎早期就有Fidgetin表達(dá)，發(fā)育晚期大腦中部分神經(jīng)節(jié)有fidgetin較強的表達(dá)[10]. Fidgetin優(yōu)先靶向富含酪氨酸的動態(tài)微管區(qū)域，特別是在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移中起重要作用，實驗表明Fidgetin能促進(jìn)源自大鼠脊髓的培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移[14]. Fidgetin作為微管剪切蛋白促進(jìn)果蠅受損的樹突退化[15]. 在斑馬魚中，實驗顯示Fidgetin like 1通過調(diào)節(jié)微管末端動態(tài)來控制生長錐的導(dǎo)向、形態(tài)和行為[16]. Fidgetin-like 2，作為細(xì)胞遷移的基本調(diào)節(jié)因子，使用納米粒子包裹的小干擾RNA(siRNA)技術(shù)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行靶向使fidgetin-like2功能缺失，可促進(jìn)傷口閉合和再生[17]. 在體外，來自哺乳動物組織培養(yǎng)細(xì)胞的fidgetinlike2的缺失導(dǎo)致細(xì)胞運動速率增加超過兩倍，免疫熒光分析表明fidgetinlike2通常定位于細(xì)胞邊緣，重要的是定位于極化細(xì)胞的前沿，它調(diào)節(jié)微管細(xì)胞骨架的組織和動力學(xué)[18].

圖1 人類Fidgetin like 1和果蠅Fidgetin序列對比

1 材料與方法

1.1 果蠅品系見表1.

1.2 Immunostaining和western blotting所使用抗體見表2.

1.3 實驗中使用的載體見表3.

1.4 實驗中使用的引物見表4.

表1 本文中使用的果蠅品系

表2 本實驗使用抗體

表3 實驗中使用的載體

表4 實驗中使用的引物

1.5 實驗方法

1.5.1 sgRNA的設(shè)計 本實驗運用網(wǎng)頁工具CRISPR optimal target finder (網(wǎng)址http://tools.flycrispr.molbio. wisc.edu/targetFinder/) 在fidgetin的序列上設(shè)計了兩條sgRNA，序列標(biāo)記為sgRNA 1、sgRNA 2. sgRNA1、sgRNA 2片段大小均在20 bp，在設(shè)計的sgRNA1、sgRNA2的5’端添加了BbsI 內(nèi)切酶的酶切位點，再交由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成帶有BbsⅠ酶切位點的單鏈sgRNA1、sgRNA2.

1.5.2 pCDF3 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 將合成的兩條單鏈sgRNA DNA序列復(fù)性(見表5). 用BbsI內(nèi)切酶切割pCDF3質(zhì)粒，膠回收得到有BbsI粘性末端的線性pCDF3質(zhì)粒. 為了使線性的pCDF3質(zhì)粒與合成的sgRNA復(fù)性得到有BbsI粘性末端的短片段雙鏈DNA連接，取0.5 μL線性pCDF 3和4.5 μL雙鏈sgRNA于PCR管中混勻，再加入5 μL solution I，放在酶連儀中16 ℃反應(yīng)2.5 h. 將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)入trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)中(來自全式金生物技術(shù)有限公司)，均勻涂在LA(加有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基)平板上，于37 ℃倒置過夜培養(yǎng). 挑取單菌落接種至5 mL LA液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)10 h，抽提質(zhì)粒并測序，將序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)并涂布至LA平板培養(yǎng). 挑取單菌落于100 mL LA液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h，用QIAGEN中提試劑盒提取質(zhì)粒并純化.由此得到pCDF3-sgRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建fidgetin無功能突變體果蠅的pCDF3 sgRNA表達(dá)載體命名為pCDF3-sgRNA1和pCDF3-sgRNA2質(zhì)粒.

表5 sgRNA1與sgRNA rev結(jié)合為雙鏈gRNA

圖2 構(gòu)建fidgetin無功能突變體實驗方案圖 將sgRNA1、sgRNA2質(zhì)粒一起注射到nos-cas9果蠅和vasa-Cas9 果蠅胚胎，然后在注射后成活的果蠅中篩選目的果蠅

1.5.3 顯微注射 本實驗所用的顯微注射實驗流程主要來自本實驗室的成功案例[19-20]. 將pCDF3-sgRNA 1和pCDF3-sgRNA 2質(zhì)?；旌显谝黄?，總濃度為150 ng/μL，注入nos-Cas9和vasa-Cas9果蠅產(chǎn)的胚胎中，將注射后成活的成蟲與Sp/CyO進(jìn)行單只雜交得到子代F1，待F1羽化后在各個培養(yǎng)管中隨機挑選6～8只進(jìn)行PCR鑒定.將鑒定有轉(zhuǎn)基因果蠅的培育管中的其它F1雄性果蠅與Sp/CyO雌性果蠅進(jìn)行單只雜交，待后代產(chǎn)出，鑒定F1雄果蠅是否出現(xiàn)突變. 鑒定方法為：提取親本果蠅的DNA，將其作為模板，用設(shè)計好的引物fidgetinF和fidgetinR進(jìn)行PCR，之后將PCR產(chǎn)物送到擎科生物公司測序，通過測序結(jié)果的峰圖讀出序列，因為非同源末端鏈接修復(fù)，可能會出現(xiàn)移碼突變. 構(gòu)建fidgetin無功能突變體的實驗方案如圖2.

1.5.4 免疫印跡fidgetin無功能突變體果蠅與野生型果蠅三齡幼蟲各取5只，剖出內(nèi)臟和大腦，留下皮，分別加入50 μL RIPA裂解液(強)和1 μL蛋白酶抑制劑放置于冰上進(jìn)行研磨，在4 ℃，14 000 r/min離心10 min取上清，測蛋白濃度，配制上樣液. 在99 ℃水浴鍋中水浴10 min，然后點樣、電泳、轉(zhuǎn)膜(將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上). 接著用0.5% PBST(1%PBS+0.5% Tween 20)配5% 的脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，加入一抗(anti-Fidgetin)在4 ℃過夜孵育，用0.5% PBST洗一抗1 h，每13 min更換一次PBST. 然后常溫孵育二抗2.5 h，洗二抗1 h，每13 min更換一次PBST. 在孵育過抗體的PVDF膜上加入曝光底物，最后顯影曝光.

1.5.5 圖片采集和數(shù)據(jù)處理 實驗中免疫組織染色均用Zeiss激光共聚焦顯微鏡LSM710采集，圖片采集后用Adobe Photoshop CS 6處理和排版. 本研究所進(jìn)行的統(tǒng)計學(xué)實驗都在3個重復(fù)以上，每組實驗均用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析，每次實驗若包括兩組實驗數(shù)據(jù)，則采用t-test進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)顯著性差異分析，若包括3組及以3組上實驗數(shù)據(jù)，則采用單因素方差分析(one-way ANOVA with Tukey’s test)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)顯著性差異分析. 處理的所有定量數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.M)的形式表示，在統(tǒng)計圖上的*表示的意義分別為：P> 0.05，沒有*(星號)說明兩組數(shù)據(jù)間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；P< 0.05用*表示，說明兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P< 0.01用**表示，說明兩組數(shù)據(jù)之間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；P< 0.001用***表示，說明兩組數(shù)據(jù)差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建考慮到不同的sgRNA可能存在不同的靶向效率，本實驗設(shè)計了兩條sgRNA以確保實驗順利進(jìn)行，將兩條sgRNA1和sgRNA2分別插入pCDF3表達(dá)載體中，測序(見圖3).

圖3 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 A)sgRNA1與sgRNA2序列的設(shè)計；B)pCDF3-sgRNA表達(dá)載體酶切后檢測瓊脂糖電泳圖；C) pCDF3與 sgRNA連接后對表達(dá)載體檢測瓊脂糖電泳圖；D)pCDF3-sgRNA1和pCDF3-sgRNA2表達(dá)載體質(zhì)粒檢測峰圖

圖4 fidgetin無功能突變體果蠅篩選 A) fidgetinM14-2突變體果蠅測序結(jié)果；B)純合個體fidgetinM14-2突變體果蠅和 野生型果蠅的序列對比，紅色標(biāo)記為fidgetinM14-2突變體果蠅插入的堿基G

2.2 獲得fidgetinnull突變體果蠅將純化過的兩個pCDF3 sgRNA質(zhì)粒稀釋至總濃度在150 ng/μL，即pCDF3 sgRNA1質(zhì)粒、pCDF3 sgRNA2質(zhì)粒各自稀釋至75 ng/μL混勻，注射入nos-Cas9果蠅和vasa-Cas9果蠅的胚胎中(胚胎發(fā)育時間為40 min)，總共注射了大約700只卵，成活30只，分別編號為F1～F10(雌性果蠅1～10號)和M1～M20(雄性果蠅1～20號). 將注射后成活的成蟲與Sp/CyO果蠅進(jìn)行單只雜交得到子代F1，待子代F1羽化后在各個培養(yǎng)管中隨機挑選6～8只果蠅，提取DNA，用設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR，然后將PCR產(chǎn)物送至武漢擎科生物公司測序，根據(jù)測序結(jié)果的峰圖看是否有突變體果蠅產(chǎn)生，經(jīng)鑒定，在F8、F10、M10、M12、M14這5管中讀取到有突變序列，將這5管的子代雄果蠅與Sp/CyO果蠅進(jìn)行單只雜交，待子代產(chǎn)出，鑒定進(jìn)行雜交的雄性親本果蠅，鑒定方法如前述(1.5.3)，最后篩選出M14中的親本雄果蠅的序列和野生型相比插入了一個堿基G(圖4)，導(dǎo)致發(fā)生移碼突變，命名為fidgetinM14-2突變體果蠅(可簡寫為fignM14-2).

圖5 FidgetinM14-2突變體果蠅蛋白水平的鑒定

2.3 穩(wěn)定遺傳的fidgetinM14-2果蠅品系的鑒定得到的純合fidgetinM14-2果蠅后，通過Western blot檢測蛋白的表達(dá)水平. 實驗中用到野生型和fidgetinM14-2兩個基因型果蠅，以actin作為參照，用Fidgetin的抗體檢測，實驗結(jié)果符合預(yù)期，如圖5，野生型檢測出Fidgetin的帶，而fidgetinM14-2果蠅沒有相對應(yīng)的帶，則表明在fidgetinM14-2果蠅中，無Fidgetin蛋白表達(dá)，由此說明我們得到了fidgetin無功能突變體果蠅.

2.4Fidgetin調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉突觸的發(fā)育為了檢測fidgetin是否影響神經(jīng)突觸的發(fā)育，本實驗觀察了三齡幼蟲的神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction, NMJ)，我們用標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞膜的HRP和標(biāo)記突觸囊泡的CSP進(jìn)行免疫染色，使用激光共聚焦顯微鏡拍攝，GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計結(jié)果顯示野生型的神經(jīng)突觸扣結(jié)分布均勻，神經(jīng)系統(tǒng)敲減了fidgetin(elav-Gal4;UAS-fidgetinRNAi)和fidgetinM14-2突變體果蠅的NMJ扣結(jié)數(shù)目增加. 我們統(tǒng)計了各個基因型的三齡幼蟲的第三體節(jié)四號肌肉的NMJ總扣結(jié)數(shù)目，fidgetinRNAi果蠅扣結(jié)數(shù)是(37 ± 2.22)個，和野生型(28 ± 0.98)個比較有顯著增加(P< 0.01)，fidgetinM14-2突變體果蠅的扣結(jié)數(shù)目是(39 ± 2.24)個，和野生型(28 ± 0.98)個比較有極顯著增加(P< 0.001)，如圖6所示.

圖6 Fidgetin調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉突觸的發(fā)育 A)將野生型、 fidgetin RNAi及fidgetinM14-2突變體果蠅的三齡幼蟲解剖染色，紅色標(biāo)記的是突出 囊泡的CSP，綠色標(biāo)記的是神經(jīng)細(xì)胞膜的HRP； B)柱狀統(tǒng)計圖顯示的是野生型、 fidgetin RNAi及fidgetinM14-2 突變體果蠅的扣結(jié)總數(shù)目(樣本數(shù)n分別為WT：18； fidgetinM14-2：20； fidgetin RNAi：25)

3 討論

本實驗用黑腹果蠅作為模式生物，運用CRISPR/Cas9技術(shù)對果蠅的fidgetin基因進(jìn)行編輯，獲得了fidgetin的無功能突變體果蠅fidgetinM14-2. 有研究表明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的錯誤調(diào)控會導(dǎo)致果蠅神經(jīng)肌肉突觸發(fā)育的異常[21].實驗中我們觀察到fidgetinRNAi、fidgetinM14-2突變體果蠅表型一致，兩者NMJ的扣結(jié)數(shù)目較野生型數(shù)目顯著增加. 這個結(jié)果和其他微管剪切蛋白Katania 60和Spastin的突變體的NMJ表型不同[22]，katania60突變體總衛(wèi)星扣結(jié)數(shù)目增加，spastin的突變體的NMJ的分支數(shù)增加，說明3種微管剪切蛋白從不同的方面調(diào)節(jié)果蠅神經(jīng)肌肉突觸的生長. 此結(jié)果也說明fidgetin對果蠅神經(jīng)肌肉突觸的發(fā)育是必須的.fidgetinM14-2突變體果蠅的NMJ的扣結(jié)數(shù)目較野生型數(shù)目顯著增加，可能會降低信號在NMJ上的傳遞效率. 另外，F(xiàn)idgetin在果蠅發(fā)育過程中的其他方面的影響還需進(jìn)一步探討.