郭靜宇，王祎麗，千新來，朱會芳

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年上升趨勢[1]。我國最新研究數(shù)據(jù)顯示：隨著腫瘤早期篩查工作的開展以及新的治療方法應(yīng)用，CRC的病死率有所下降，但是其發(fā)病率卻明顯上升且日益年輕化[2]。CNN2(calponin 2)是一種肌動蛋白細胞骨架結(jié)合蛋白，可以結(jié)合肌動蛋白、鈣調(diào)蛋白、肌鈣蛋白和肌球蛋白[3]，參與細胞骨架形成、肌肉收縮和細胞黏附[4]。目前，CNN2在腫瘤的發(fā)生及進展中報道并不一致[5-8]。本文著重探討CNN2在CRC細胞中的表達及其侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，以期為CRC的臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1結(jié)直腸癌組織 收集2017～2021年我院病理科保存的30例結(jié)直腸癌石蠟標本。其中男性15例，女性15例，年齡35～65歲。腫瘤分化程度：低分化5例，中分化12例，高分化13例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移17例，無轉(zhuǎn)移13例。入選標準：(1)結(jié)直腸癌；(2)術(shù)前未接受放、化療；(3)石蠟標本經(jīng)HE染色示具有結(jié)直腸癌及癌旁正常組織結(jié)構(gòu)。

1.1.2細胞系 人正常結(jié)直腸細胞NCM460和人CRC細胞株HCT116、SW620、HCT-8、RKO、LOVO、DLD-1，均由本實驗室自主保存。

1.1.3主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國Hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自上海索萊寶生物公司。蛋白裂解液、BCA測蛋白濃度工作液、5×SDS蛋白上樣緩沖液、SDS凝膠試劑盒，均購自上海碧云天公司。蛋白Marker購自美國Thermo公司；GAPDH單克隆抗體、E-cadherin、N-cadherin和vimentin抗體，均購自Proteintech公司；CNN2多克隆抗體購自美國Abcam公司；SP免疫組化超敏試劑盒及DAB顯色劑，均購自北京中杉金橋公司。ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光液，購自上海雅酶公司；PVDF膜購自美國GE公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量試劑盒，均購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法檢測CNN2和E-cadherin蛋白的表達。標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟及水化，抗原修復(fù)、封閉、滴加一抗等，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照，具體操作步驟嚴格按SP及DAB顯色劑說明書進行。

結(jié)果判定：由兩名病理科醫(yī)師獨立完成閱片和判讀，每張切片隨機選取5個高倍視野。CNN2抗體陽性著色分布于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。E-cadherin抗體陽性著色分布于細胞膜，呈棕黃色。(1)根據(jù)陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽性細胞百分率計分：陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩者得分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，>8分為強陽性()；其中(-)和(+)為低表達，()和()為高表達。

1.2.2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇本實驗室保存的人正常結(jié)直腸細胞NCM460和人CRC細胞株HCT116、SW620、HCT-8、RKO、LOVO、DLD-1，使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，選擇處于生長對數(shù)期的細胞作為研究對象。

細胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的CRC細胞HCT-8、HCT116，胰酶消化并接種于6孔板中，使細胞匯合度達40%～50%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前用PBS沖洗6孔板洗2次，加入1.5 mL的opti-MEM培養(yǎng)基，然后每孔另配0.5 mL的轉(zhuǎn)染體系。每孔對應(yīng)2個EP管，均加入0.25 mL opti-MEM培養(yǎng)基，2個管中分別加入10 μL轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的siRNA和5 μL Lipofectamin 2000脂質(zhì)體混勻，靜置5 min。將opti-MEM-siRNA和脂質(zhì)體混合，離心20 s后靜置20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將復(fù)合物均勻的加入6孔板中，培養(yǎng)6～8 h，換成含血清無雙抗的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后可收集細胞團提取RNA，48 h后可收集細胞團提取蛋白。細胞分組：對照組(NC組)、干擾CNN2組(si-CNN2組)。

1.2.3qRT-PCR法 取對數(shù)生長期的人正常結(jié)直腸細胞NCM460和人CRC細胞HCT116、SW620、HCT-8、RKO、LOVO、DLD-1，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，分光光度計測量總RNA濃度及純度，取1 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Master Mix試劑盒說明書進行qRT-PCR檢測。CNN2引物序列：CNN2正義鏈：5′-ATCAAGGCCATGGTCAGCTA-3′；CNN2反義鏈：5′-ATGGTGGCATCGTCGAAATT-3′。根據(jù)2-ΔΔCt值計算相對表達量，實驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.2.4Transwell小室實驗檢測細胞的侵襲能力 收集對數(shù)生長期的干擾組si-CNN2 CRC細胞以及對照組si-NC細胞，先用胰酶消化各組細胞，然后用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，制成單細胞懸液。將200 μL單細胞懸液(含1×105個細胞)接種于Transwell小室的上室；用500 μL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基作為趨化因子置于下室，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用棉簽輕輕擦拭上層未遷移細胞，PBS沖洗3次，將膜用刀片劃下置于可吸附載玻片上，滴加中性樹膠封固，在正置光學(xué)顯微鏡下選取不同視野進行計數(shù)并拍照。最后，取均值并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.5劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力 取對數(shù)生長期的干擾組si-CNN2 CRC細胞以及對照組NC細胞，用胰酶消化轉(zhuǎn)染后的各組細胞制成單細胞懸液。然后將兩組細胞接種于6孔板中(按5×105個/孔)，將不同組的細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；待細胞的融合達90%時，用10 μL的無菌槍頭劃板，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕洗3次。最后于倒置顯微鏡10倍視野下取點，分別記錄劃板0、24、48 h痕跡寬度的不同變化。同時，利用Image J軟件測量其細胞的遷移距離，并計算細胞的遷移率。計算方法：細胞遷移率=(24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6Western blot法 收取轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)48 h后的HCT116、HCT-8細胞團以及對應(yīng)的對照組細胞團，加入適量細胞裂解液，蛋白酶抑制劑后置于冰上裂解30 min，離心收取蛋白上清。用BCA蛋白檢測試劑盒，檢測并計算蛋白上樣量。常規(guī)配置10%分離膠和5%濃縮膠，按照計算的上樣量上樣，80 V 30 min電泳至蛋白Marker分離，調(diào)至120 V跑分離膠。用PVDF膜按三明治結(jié)構(gòu)順序進行轉(zhuǎn)膜，結(jié)束轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h。裁剪對應(yīng)分子量常規(guī)敷抗體，用曝光儀曝光條帶。

2 結(jié)果

2.1 CRC和癌旁正常組織中CNN2蛋白的表達及與臨床病理特征的關(guān)系CNN2陽性定位于細胞質(zhì)和細胞膜；30例CRC中CNN2高表達23例，低表達7例，提示CRC組織中CNN2的表達明顯高于癌旁正常腸黏膜組織(P<0.001，表1，圖1)。本組分析CRC組織中CNN2表達與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：CNN2表達與患者性別(P=0.464)、年齡(P=0.713)和分化程度(P=0.076)均無關(guān)；與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.010)及TNM分期(P=0.014)有關(guān)(表2)。

表2 結(jié)直腸癌中CNN2表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 CNN2在癌旁正常組織及結(jié)直腸癌組織中的表達：A.CNN2在癌旁正常組織中的表達；B.CNN2在結(jié)直腸癌組織中的表達，SP法

表1 結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中CNN2的表達

2.2 不同CRC細胞株中CNN2 mRNA的表達采用qRT-PCR法檢測CNN2 mRNA在正常人結(jié)直腸細胞NCM460和6種不同CRC細胞株中的表達。結(jié)果顯示：與正常結(jié)直腸細胞NCM460相比，CRC細胞株HCT116、SW480、SW620、HCT-8、RKO、LOVO、DLD-1中CNN2的相對表達量分別為4.143±0.607、3.753±0.277、2.495±0.209、2.533±0.306、5.822±0.475、9.615±0.478；提示與正常結(jié)直腸細胞相比，CNN2在CRC細胞株中的表達明顯上調(diào)(P<0.05，圖2)。

圖2 qRT-PCR法檢測CNN2 mRNA在正常人結(jié)直腸細胞NCM460和結(jié)直腸癌細胞株中的表達：與NCM460相比，*P<0.05，**P<0.01)

2.3 干擾片段的篩選選取CNN2表達較穩(wěn)定的2株CRC細胞(HCT116和HCT-8)作為實驗對象。靶向CNN2的3條干擾片段分別轉(zhuǎn)染HCT116和HCT-8細胞，每種細胞設(shè)干擾組(si-CNN2-1、si-CNN2-2及si-CNN2-3)和對照組(si-NC)，通過qRT-PCR法分別檢測3條干擾片段的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示：與si-NC相比，HCT116細胞中si-CNN2-1、si-CNN2-2及si-CNN2-3組中CNN2的相對表達量分別為：0.136±0.124(P<0.05)、0.135±0.013(P<0.001)和0.08±0.103(P<0.05)。干擾效率分別為：66.4%、66.5%、92%。HCT-8細胞中si-CNN2-1、si-CNN2-2及si-CNN2-3組中CNN2的相對表達量分別為：0.486±0.033(P<0.01)、0.129±0.021(P<0.001)和0.106±0.013(P<0.01)。干擾效率分別為：51.4%、87.1%、89.4%。因此，選用干擾效果最好的siRNA-3用于后續(xù)實驗。

2.4 干擾CNN2與CRC細胞的侵襲和遷移的關(guān)系通過Transwell侵襲實驗檢測干擾CNN2后，觀察CRC細胞侵襲能力的變化。結(jié)果顯示：si-NC組和si-CNN2組HCT116細胞侵襲數(shù)分別為137.67±5.25和51±5.35，HCT-8細胞的si-NC組和si-CNN2組侵襲數(shù)分別為178.33±12.28和89±3.27；提示與si-NC相比，干擾CNN2后CRC細胞HCT116和HCT-8的侵襲數(shù)明顯減少(P<0.001，圖3A、B)。

通過劃痕愈合實驗檢測干擾CNN2后，CRC細胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示：HCT116細胞si-NC組和si-CNN2組劃痕遷移率分別為(55.4±0.9)%和(24.2±4.3)%，si-NC組和si-CNN2組HCT-8細胞劃痕遷移率分別為(57.3±1.6)%和(24.05±2.65)%。CRC細胞的遷移能力與si-NC組相比，干擾CNN2后CRC細胞遷移率明顯降低(P<0.05，圖3C、D)。以上結(jié)果說明干擾CNN2后，能抑制CRC細胞的侵襲和遷移能力。

圖3 CNN2對結(jié)直腸癌細胞HCT116和HCT-8侵襲和遷移的影響：A.Transwell侵襲實驗檢測CNN2對結(jié)直腸癌HCT116和HCT-8侵襲的影響；B.Transwell侵襲實驗的統(tǒng)計學(xué)分析，***P<0.01；C.劃痕愈合實驗檢測CNN2對結(jié)直腸癌細胞HCT116和HCT-8遷移的影響；D.劃痕愈合實驗的統(tǒng)計學(xué)分析，*P<0.05

2.5 干擾CRC細胞CNN2對EMT相關(guān)蛋白表達的影響Western blot結(jié)果顯示：與si-NC組相比，干擾CNN2后HCT116和HCT-8細胞中的上皮標志物E-cadherin的表達(分別為：1.615±0.047、1.229±0.073)增加(P<0.05，圖4)，而間葉標志物N-cadherin和vimentin的表達(N-cadherin分別為：0.597±0.181 5、0.451±0.003 5；vimentin分別為：0.723±0.047 5、0.676±0.134)均下降(P<0.05，圖4)；提示干擾CNN2能抑制CRC細胞的EMT進程，EMT可能參與CNN2的促癌作用。

圖4 Western blot法檢測干擾結(jié)直腸癌細胞CNN2對EMT相關(guān)蛋白表達的影響：A.Western blot法檢測干擾CNN2后，HCT116細胞中EMT相關(guān)蛋白的表達；B.Western blot法檢測干擾CNN2后，HCT-8細胞中EMT相關(guān)蛋白的表達

2.6 CRC和癌旁正常組織中E-cadherin表達與CNN2的相關(guān)性免疫組化結(jié)果顯示，E-cadherin陽性定位于細胞膜(圖5)；30例CRC中E-cadherin高表達4例，低表達26例，提示CRC組織中E-cadherin的表達明顯低于癌旁正常腸黏膜組織(P<0.05)。應(yīng)用Spearman秩統(tǒng)計學(xué)方法分析CRC組織中E-cadherin和CNN2蛋白表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CNN2與E-cadherin的表達呈負相關(guān)(r=-0.866，P<0.01)。

圖5 E-cadherin在癌旁正常組織及結(jié)直腸癌組織中的表達：A.E-cadherin在癌旁正常組織中的表達；B.E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達，SP法

3 討論

CNN2是一種細胞骨架結(jié)合蛋白，參與細胞骨架形成、肌肉收縮和細胞黏附。CNN2在多種腫瘤組織中均表達[9-10]，還可以作為肝癌、乳腺癌的血清診斷潛在的特異性標志物[11-13]。近年，研究表明CNN2的降低與前列腺癌易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。潘妍等報道CNN2在CRC組織與正常結(jié)直腸組織相比，其表達量明顯降低，下調(diào)CNN2后促進CRC細胞在體外的增殖、遷移能力增強等。Choi等通過RT-PCR法檢測12例患者直腸癌細胞及相應(yīng)正常直腸細胞的基因表達譜，結(jié)果顯示CNN2在直腸癌細胞中呈高表達，可能參與直腸癌的發(fā)生。目前，CNN2在CRC中的具體作用機制尚未見報道。本實驗首先檢測CNN2在CRC組織及細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)CNN2在兩者中呈高表達，說明CNN2對于CRC的發(fā)生、發(fā)展具有調(diào)控作用。為了明確CNN2在CRC細胞的侵襲、遷移中作用，通過細胞體外Tarnswell侵襲實驗、劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn)，干擾CNN2后CRC細胞的侵襲和遷移能力下降。

EMT是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要機制之一，上皮細胞在部分因素的作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得游走性和浸潤性的遷移能力，變成具有間質(zhì)細胞形態(tài)和特性的細胞改變[15-17]。在細胞發(fā)生EMT過程中，常伴細胞骨架以及相關(guān)表型的改變，如上皮標志物E-cadherin的下降以及間質(zhì)標志物vimentin和N-cadherin的表達增加[18-20]。我們猜想CNN2可能參與了腫瘤的EMT進程，進而促進了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。為了探討CNN2可能參與CRC的發(fā)生機制，采用Western blot法檢測CNN2對EMT相關(guān)蛋白的影響，干擾CNN2后，CRC細胞HCT116、HCT-8中EMT相關(guān)上皮標志物E-cadherin表達量明顯增加，間質(zhì)標志物vimentin、N-cadherin表達量下降。此結(jié)果表明，CNN2可能通過CRC細胞的EMT進程促進CRC細胞的侵襲、遷移能力。采用免疫組化法檢測CRC組織中CNN2與E-cadherin的表達，并應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析兩者的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNN2與E-cadherin表達呈負相關(guān)，提示CNN2可能通過促進EMT發(fā)揮促癌作用。但是CNN2促進EMT進程的具體調(diào)控機制尚不明確，未來需要進一步深入分析。

綜上所述，CNN2在CRC細胞中呈高表達，其可能通過促進CRC細胞的EMT表型改變，從而促進CRC細胞侵襲和遷移的能力，為CRC的診療提供了新的治療思路。