摘要：果蠅是一種常見(jiàn)的模式生物，在胚胎發(fā)育、疾病的發(fā)病機(jī)制以及基因表達(dá)調(diào)控等研究中發(fā)揮極其重要的作用。果蠅應(yīng)激反應(yīng)最主要涉及的是 JNK 信號(hào)通路，是一種真核生物進(jìn)化保守的信號(hào)通路。因此研究JNK信號(hào)通路中各基因的作用至關(guān)重要。本次實(shí)驗(yàn)主要目的是將果蠅JNK信號(hào)通路中的egr基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，觀察其對(duì)果蠅的影響。本文將對(duì)本次實(shí)驗(yàn)中egr基因過(guò)表達(dá)的pUAST載體構(gòu)建做一個(gè)詳細(xì)說(shuō)明。

關(guān)鍵詞：egr基因;分子克隆;載體構(gòu)建

果蠅應(yīng)激反應(yīng)最主要涉及的是JNK信號(hào)通路，該通路是指一種由一系列內(nèi)在和外在的應(yīng)激源所誘發(fā)的應(yīng)激活化蛋白激酶途徑，是一種真核生物進(jìn)化保守的信號(hào)通路，調(diào)控廣泛的細(xì)胞過(guò)程如細(xì)胞凋亡等。[1]egr是果蠅中TNF唯一的同源物，啟動(dòng)TNF-JNK通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。[2]本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建果蠅egr基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入果蠅體內(nèi)并使其表達(dá)，觀察egr基因過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

一、基因序列和pUAST載體信息

（一） egr基因序列

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇gene，輸入egr選擇物種為果蠅，查看genbank序列，得到egr基因的兩個(gè)變體isoform A和isoform B，使用較長(zhǎng)的isoform A來(lái)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

（二）pUAST質(zhì)粒信息

下圖為pUAST序列信息，我們可以詳細(xì)看到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)及其序列。

二、PCR引物設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)是用一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成。

引物設(shè)計(jì)過(guò)程中有以下注意要點(diǎn)：

（一）引物長(zhǎng)度一般為15—30bp，其有效長(zhǎng)度[Ln=2（G十C）十（A十T）]一般不大于38，否則會(huì)降低產(chǎn)物的特異性。

（二）G十C含量應(yīng)在40%一60%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般較Tm值低等于引物的Tm值減去5—10度。

（三）堿基分布盡量保證隨機(jī)性，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基，尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過(guò)3個(gè)的連續(xù)G或C，否則會(huì)使引物在G十C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

（四）引物不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。

（五）兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。

（六）一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。

（七）引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少3個(gè)核苷酸，起到保護(hù)作用。

本次引物設(shè)計(jì)使用的軟件為primer premier 5.0。通過(guò)egr基因CDS序列與pUAST的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，確定限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，保證在酶切時(shí)不破壞egr基因的編碼區(qū)。

三、PCR反應(yīng)

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，DNA雙鏈解離成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;2、模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;3、引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成一條新的互補(bǔ)鏈;4、重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。[4]

實(shí)驗(yàn)中先將果蠅的總RNA提取出來(lái)，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在PCR反應(yīng)體系中依次加入以下試劑：10 x PCR buffer 2.5μl，dNTP 2μl，cDNA 2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA Polymerase 0.5μl（必須選用高保真的DNA聚合酶），ddH2O 16μl。經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸步驟后，得到擴(kuò)增的DNA序列。制作1%瓊脂糖凝膠，用PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳后進(jìn)行切膠回收。

四、目的基因插入載體

先將PCR擴(kuò)增得到的egr基因和pUAST質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行電泳來(lái)分離酶切后的線性質(zhì)粒和未被酶切的質(zhì)粒，通過(guò)凝膠純化來(lái)純化回收。使用DNA連接酶將帶有粘末端的egr基因和線性質(zhì)粒連接，得到egr-pUAST質(zhì)粒。注意最好使連接片段與載體的比為3：1，以保證只有少量的載體發(fā)生自連，提高載體構(gòu)建的效率。然后將egr-pUAST質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)的大腸桿菌進(jìn)行復(fù)制轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂至含抗生素的瓊脂板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌可以在瓊脂板上形成菌落，挑取多個(gè)單克隆菌落接種到含培養(yǎng)液的管中，在搖床培養(yǎng)箱中擴(kuò)增。擴(kuò)增后的少量培養(yǎng)物在編號(hào)的瓊脂板上涂板，其余用于質(zhì)粒純化后用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，將切割后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳來(lái)確定大腸桿菌轉(zhuǎn)化的使含插入片段的質(zhì)粒而非自連的質(zhì)粒。將確定含插入片段質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將質(zhì)粒純化。最后將所得的片段進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證目的基因得到了克隆，然后保種。[3]

五、總結(jié)

本次實(shí)驗(yàn)將用到分子克隆這一技術(shù)，將egr基因插入到pUAST質(zhì)粒后導(dǎo)入果蠅中，讓egr基因在果蠅中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，觀察egr基因過(guò)表達(dá)后對(duì)果蠅產(chǎn)生的影響?？偨Y(jié)目前所做的工作可以發(fā)現(xiàn)，引物設(shè)計(jì)是該實(shí)驗(yàn)中最困難、也是最容易出現(xiàn)問(wèn)題的地方。另外，酶切位點(diǎn)的尋找和選擇也是一項(xiàng)技術(shù)性工作。在今后的實(shí)驗(yàn)中要加強(qiáng)對(duì)相關(guān)內(nèi)容的學(xué)習(xí)和操作，以便能成功學(xué)好分子克隆這項(xiàng)技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐成晨，賈佳.果蠅JNK信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2019，36（03）：78-82.

[2]薛奮勤，許晴，魏華， 等.僅采用 PCR 進(jìn)行分子克隆的方法探索[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，

作者簡(jiǎn)介：

唐鵬程 王繼善 王永賽，臨沂大學(xué)。