劉真陽 張碧霄 李非凡 梅曉宏

摘?要：目的：優(yōu)化白果中植物甾醇的提取并考察其體外釋放情況。方法：以白果為原料，以乙醇為提取溶劑，使用超聲波輔助提取法，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優(yōu)化了白果中植物甾醇的提取工藝，進一步通過體外模擬消化試驗，分析了添加油脂、熱處理方式、物料粉碎程度對甾醇體外釋放的影響。結果：超聲時間、料液比、超聲功率均影響甾醇的提取率。超聲功率對提取率具有顯著影響，最佳工藝為超聲時間6 min、料液比1∶15 g/mL、超聲功率350W，此時可得最大甾醇提取率為0.878 mg/（g·dw）。體外模擬消化試驗證明，添加油脂、熱處理方式、物料粉碎程度均對植物甾醇的體外釋放具有顯著影響，當使用微波加熱處理時，甾醇的釋放情況最佳。

關鍵詞：白果;植物甾醇;模擬消化

銀杏的種子——白果，其營養(yǎng)豐富，具有益肺氣、治喘咳、止滯濁、擴張微血管、增加血流量等藥用功效，食用價值很高[1?2]。植物甾醇是植物中的活性成分，其廣泛存在于各種植物油、堅果和植物種子中，在結構上與膽甾醇相似[3]。作為一類獨特的多功能活性因子，植物甾醇具有許多重要的生理功能，在心血管疾病的預防與緩解、抗腫瘤以及消炎退熱等方面應用前景廣闊[4?6]?；谥参镧薮紝θ梭w的諸多功能及其特有的性質(zhì)，植物甾醇已在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)中得到了廣泛應用[7?8]。然而，人體不能合成植物甾醇，只能從食物中攝取。且膳食中植物甾醇的吸收率較低，約為0.02%～3.5%[9]，這與植物甾醇的水溶性差有關，已有研究證明，烹調(diào)過程中添加適量油脂有利于提高脂溶性成分的生物利用率[10]。不僅如此，烹調(diào)方式與物料性質(zhì)對營養(yǎng)成分的釋放具有較大影響[11?12]。目前，對于白果中植物甾醇的研究較少。本研究對白果中的植物甾醇進行提取工藝優(yōu)化、含量測定，并分析體外釋放情況，模擬蒸、煮、微波3種烹飪方式對甾醇釋放的影響，以期提高白果的利用率。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

白果、大豆油，購于當?shù)爻?β?谷甾醇標準品、胃蛋白酶、豬膽鹽、脂肪酶，美國Sigma公司;無水乙醇、六水合三氯化鐵、無水氯化鈣、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氫氧化鉀、磷酸，分析純，購自西亞試劑。

1.2?儀器與設備

FW100型高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司;Varioskan Flash全波長酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司;JY98?IIIN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;101?0ES型電熱鼓風干燥箱，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司;TGL?16M臺式高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司;LGJ?25C型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?單因素試驗?預先將白果去殼、冷凍干燥并粉碎處理，記錄凍干前、后白果的重量，分別記為Wf、Wd，并計算白果的含水率[13]，公式為式（1）：

含水率（%）=Wf-WdWf×100（1）

以凍干后的白果粉為原料，選擇無水乙醇為提取溶劑，使用超聲波細胞破碎儀進行白果中植物甾醇的提取。準確稱取2.0 g白果粉，加入一定量的無水乙醇，使用超聲波細胞破碎儀破壁處理，將提取液置于70℃烘箱中，徹底烘干，之后重新加入20 mL無水乙醇，混合均勻后，取溶有植物甾醇的乙醇溶液用于后續(xù)植物甾醇的定量分析，計算干物質(zhì)（白果粉）中植物甾醇的含量[mg/（g·dw）]，下同。固定料液比1∶10 mL/g、超聲時間6 min，選取超聲功率分別為200、250、300、350、400W進行試驗，考察超聲功率對植物甾醇提取率的影響。在料液比為1∶10 mL/g、超聲功率為350 W的條件下，選取超聲時間分別為2、4、6、8、10 min進行試驗，考察超聲時間對植物甾醇提取率的影響。在超聲功率為350 W、超聲時間為6 min的條件下，選取料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 mL/g進行試驗，考察料液比對植物甾醇提取率的影響。

1.3.2?植物甾醇提取的正交試驗?單因素試驗結果表明，超聲時間（A）、料液比（B）、超聲功率（C）均可影響白果中植物甾醇的提取。為獲得最佳甾醇提取率，采用正交試驗L9（34）對上述因素進行優(yōu)化（表1）。

1.3.3?植物甾醇含量的測定?采取硫磷鐵法測定樣品中植物甾醇的含量[14]。精確稱取1.25 g六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O），使用85%的磷酸定容至50 mL，制得鐵貯存液，室溫下可長期貯存于棕色瓶中。量取8 mL鐵貯存液，使用濃硫酸定容至100 mL，制得硫磷鐵顯色劑。標準曲線的繪制方法為：使用少量無水乙醇將10 mg β?谷甾醇標準品溶解，并轉入100 mL容量瓶中定容。使用前稀釋10倍，即母液質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL的0.1 mg/mL β?谷甾醇溶液于試管中，繼續(xù)添加無水乙醇至4.0 mL，加入2.0 mL硫磷鐵顯色劑，振蕩搖勻，15 min后在波長750～450 nm內(nèi)掃描，確定最大吸收波長。并以β?谷甾醇溶液質(zhì)量濃度（單位為mg/mL）為橫坐標、以吸光度值（A）為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣品在最大吸收波長處的吸光值以及擬合線性良好的標準曲線計算樣品中植物甾醇的含量。

1.3.4?體外模擬胃腸道消化試驗?參考Huang等[15]的方法并稍作修改。將新鮮白果去殼，稱取5 g去殼白果，并對其進行3種烹調(diào)處理，分別為：（1）煮：沸水中煮約15 min;（2）蒸：隔水加熱約30 min;（3）微波：微波加熱約5 min。之后，將熟白果分別進行粉碎與切塊（0.3 cm3左右）處理，模擬消化前加入不同質(zhì)量的大豆油（不添加、0.5 g、1.0 g、1.5 g）。在此基礎上，研究烹調(diào)方式、粉碎程度、油的添加量對熟白果中植物甾醇釋放率的影響。模擬消化過程為：按照1∶10（w/v）的比例將白果與50 mL模擬胃液[0.32%胃蛋白酶（3 000 U/mL），0.2%NaCl，w/v]混合，使用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，在37℃、120 r/min的恒溫搖床中模擬胃消化1 h。之后，按照1∶10（w/v）的比例向胃消化?1 h后的樣品中加入50 mL模擬腸液（0.68%K2HPO4、5 mmol/L CaCl2、10 mg/mL豬膽鹽、0.4 mg/mL脂肪酶，w/v），使用1mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在37℃、60 r/min的恒溫搖床中繼續(xù)模擬腸消化2 h。

消化結束后，將消化液在8 000 r/min下離心10 min，離心后，上層為含有甾醇的油相，中層為水相，下層為消化后的固體殘渣。取上層油相進行皂化處理，具體方法為：稱取50 mg油脂樣品，加入2 mL皂化液（2 mol/L氫氧化鉀?乙醇溶液），加蓋密封，混勻，渦旋振蕩?1 min;置于70℃恒溫水浴鍋中振搖皂化45 min。室溫冷卻后加入二氯甲烷5 mL、超純水3 mL，混合均勻，?6 000 r/min離心5 min，使用分液漏斗收集下層有機相，使用5 mL超純水清洗3次，棄上清，烘干有機相。使用無水乙醇重新定容至10 mL，用于后續(xù)植物甾醇的定量分析。以加入等量大豆油為對照組，計算模擬消化后植物甾醇的釋放量，公式為式（2）：

釋放量[mg/（g·dw）]=處理組甾醇含量-對照組甾醇含量1-含水量（2）

1.4?數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗均重復3次，使用SPSS 17.0軟件進行方差試驗設計與單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著;使用Origin 8.0軟件進行圖形繪制。

2?結果與分析

2.1?標準曲線的繪制

β?谷甾醇溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）與吸光度值（A）的線性關系如圖1所示，標曲方程為Y（A）=5.007X-0.012，決定系數(shù)R2=0.987 7，說明擬合情況良好，可用于后續(xù)試驗中植物甾醇的定量分析。

2.2?單因素試驗

2.2.1?超聲時間對植物甾醇提取率的影響?由圖2可知，當超聲時間為2～10 min時，植物甾醇提取率呈現(xiàn)出先增大再減小的變化趨勢，在8 min時達最大值，且顯著高于其他組（P<0.05），因此選擇6、8、10 min三個水平用于后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.2.2?料液比對植物甾醇提取率的影響?由圖3可知，當料液比為1∶15 mL/g時提取率最大，顯著高于其他組（P<0.05），因此選擇1∶10、1∶15、1∶20 g/mL三個水平用于后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.2.3?超聲功率對植物甾醇提取率的影響?由圖4可知，當超聲功率為200～400 W時，植物甾醇提取率呈現(xiàn)出先增大再減小的變化趨勢，當超聲功率為350W時達最大值，且顯著高于其他組（P<0.05），因此選擇300、350、400 W三個水平用于后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.3?正交試驗及方差分析

按照正交試驗表進行提取優(yōu)化，如表2所示，根據(jù)正交試驗的直觀分析法可得到因素的主次順序依次為超聲功率（因素C）、料液比（因素B）、超聲時間（因素A）。主要因素（超聲功率）取最佳水平，次要因素（超聲時間、料液比）根據(jù)成本等取適當水平，由此得到各因素的最佳搭配為A1B2C2，即最佳工藝為超聲時間6 min、料液比1∶15 g/mL、超聲功率350W，此時可得最大甾醇提取率為0.878 mg/（g·dw）。如表3所示，只有超聲功率（因素C）的P值=0.014<0.05，即超聲功率對試驗結果影響顯著，而超聲時間（因素A）與料液比（因素C）的P值均大于0.05，說明二者對甾醇提取率具一定影響，但并不顯著。即超聲功率為主要因素，超聲時間與料液比為次要因素，這一結果與直觀分析法的結論相符。

2.4?體外模擬消化處理中植物甾醇的釋放情況

如表4所示，其中未加入大豆油時，離心后僅有水層與下層殘渣，無明顯上層油相，因此無法檢測到甾醇的釋放情況，這是因為白果的脂肪含量較少，僅占鮮重的2%左右，這也說明，僅有加熱處理與消化液不足以促進甾醇的釋放。樣品粉碎后，使用微波處理時，隨著油的增多，甾醇釋放率呈現(xiàn)出顯著上升后趨于平穩(wěn)的趨勢（P<0.05）;使用蒸、煮處理時，加入1.5 g大豆油時甾醇的釋放率顯著升高（P<0.05），這說明添加油脂可以有效改善甾醇的釋放情況，這是因為植物甾醇是一種極性較弱且微量的物質(zhì)，同樣弱極性的油脂可以較好地溶解植物甾醇，這與已有研究結果相似[16]。當添加等量大豆油時，微波處理后甾醇的釋放率均顯著高于蒸、煮處理（P<0.05），這說明，與蒸、煮相比，微波處理可以更有效地促進白果中植物甾醇的釋放，這可能是由于微波處理能夠有效地破壁，使細胞內(nèi)容物釋放到油脂中[17]。對于塊狀樣品，不同處理方式下其甾醇釋放率均較低，且處理方式對其甾醇釋放率無顯著影響（P<0.05），這說明物料的粉碎程度對甾醇的釋放影響較大，這可能是因為粉碎處理增大了物料與消化液的接觸面積。樊金嶺等[18]研究表明，不同機械加工方式對胡蘿卜中β?胡蘿卜素生物接近度的影響較大，打漿處理可有效提高β?胡蘿卜素的釋放率與膠束化率。上述結果說明，添加油脂更有利于甾醇的釋放，而微波處理可代替?zhèn)鹘y(tǒng)蒸、煮，進一步促進白果中甾醇的釋放。

3?結論

本研究使用超聲波輔助提取法進行白果中植物甾醇的提取，通過單因素試驗，驗證了超聲時間、料液比、超聲功率均會影響甾醇的提取率。在此基礎上，通過正交試驗發(fā)現(xiàn)，超聲功率對甾醇提取率具有顯著影響（P<0.05），因素的主次順序依次為超聲功率、料液比、超聲時間，最佳工藝為超聲時間6 min、料液比1∶15 g/mL、超聲功率350W，此時可得最大甾醇提取率為0.878 mg/（g·dw）。通過體外模擬消化試驗分析白果中植物甾醇的體外釋放情況，發(fā)現(xiàn)粉碎樣品與添加油脂均有利于甾醇的釋放，與傳統(tǒng)蒸、煮相比，微波處理可進一步促進甾醇的釋放?！?/p>

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Extraction Optimization and in Vitro Release of Phytosterol from Ginkgo

LIU Zhen?yang，ZHANG Bi?xiao，LI Fei?fan，MEI Xiao?hong

（College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract：?Objective To optimize the extraction of phytosterol from ginkgo and further evaluate in vitro release of phytosterol. Method Ultrasonic?assisted extraction was used and orthogonal test was applied for optimization.Simulated digestion experiment was carried out to analyze the effect of additional oil，heat treatment and grinding on in vitro release of phytosterol. Result Based on the single factor experiment，extraction time，solid?liquid ratio，and ultrasonic power could affect extraction efficiency，while only ultrasonic power showed significant influence according to orthogonal test.Besides，the optimization was extraction time 6 min，the ratio of material to solvent 1∶15 g/mL，and ultrasonic power 350 W.Under these conditions，the theoretic yield was 0.878 mg/（g·dw）.Simulated digestion experiment evidenced that additional oil，heat treatment and thorough grinding facilitated phytosterol release，and microwave heat?treatment showed the best release ratio.

Keywords：ginkgo;phytosterol;simulated digestion