嚴(yán)禮 肖穩(wěn) 郭焜鵬 何娟 劉卓靈 余正

摘 要：目的：研制一種對(duì)沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）和單增李斯特菌（Listeria monocytogens）的選擇性共增菌培養(yǎng)基（SSSL培養(yǎng)基）。方法：挑選添加成分進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定SSSL培養(yǎng)基的成分及配比，采用平板計(jì)數(shù)法驗(yàn)證SSSL培養(yǎng)基的增菌效果。結(jié)果：確立了SSSL培養(yǎng)基配方，目標(biāo)菌在SSSL增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后，菌體濃度都達(dá)到了105～10?6CFU/mL，而且抑制非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)。結(jié)論：SSSL培養(yǎng)基能用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單增李斯特菌選擇性共增菌，可望與多種檢測(cè)方法聯(lián)用，以提高檢測(cè)率和準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌;金黃色葡萄球菌;志賀氏菌;單增李斯特菌;共增菌;選擇性培養(yǎng)基

食源性致病菌的污染是導(dǎo)致食品安全問(wèn)題的重要因素[1]，食源性致病菌的快速檢出是有效預(yù)防和控制食源性疾病的關(guān)鍵點(diǎn)。沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）和單增李斯特菌（Listeria monocytogens）是常見(jiàn)的污染肉類、果蔬、海產(chǎn)品而引發(fā)致病的菌種，所以這4種常見(jiàn)食源性致病菌的快速檢出尤為重要和迫切[2]。這幾種食源性致病菌的檢測(cè)方法已經(jīng)得到確定，其中沙門氏菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[3]檢出時(shí)間一般是6～7 d;金黃色葡萄球菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[4]檢出時(shí)間一般是4～5 d;單增李斯特菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[5]檢出時(shí)間一般是5～7 d;志賀氏菌的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[6]檢出時(shí)間一般是4～6 d。多重PCR[7]、多重?zé)晒釶CR[8]、DNA微陣列雜交技術(shù)[9]、免疫微陣列技術(shù)[10]和生物傳感器[11]等一系列新技術(shù)新方法也逐步應(yīng)用于微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域中，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)法和現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)都需要增菌過(guò)程，微生物培養(yǎng)基是富集多種目標(biāo)菌而達(dá)到檢測(cè)限、縮短增菌時(shí)間和降低檢測(cè)背景復(fù)雜性的有效手段，更是實(shí)現(xiàn)各種檢測(cè)方法簡(jiǎn)化，實(shí)現(xiàn)快檢和共檢的重要基礎(chǔ)。本研究旨在提供能夠培養(yǎng)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單增李斯特菌的選擇性共增菌培養(yǎng)基（SSSL培養(yǎng)基），這將能優(yōu)化4種食源性常見(jiàn)致病菌的傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法，也能更好地體現(xiàn)現(xiàn)代快速檢測(cè)方法的效率。

1?材料與方法

1.1?菌種

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，CMCC 47731）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC 41002）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，CMCC 51571）、單增李斯特菌（Listeria monocytogens，CMCC 34761）、大腸桿菌（Escherichia coli，CMCC 44102）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，CMCC 20015）均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，CMCC 63501）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus，CMCC63301）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，CMCC 10211），青島海博生物技術(shù)公司;小腸耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica，CMCC 52225），中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

1.2?主要試劑與儀器

胰酪胨大豆肉湯（TSB），美國(guó)BD公司;麥芽提取物、蛋白胨，英國(guó)OXOID公司;谷氨酰胺，美國(guó)Thermo Fisher公司;牛肉浸膏、氯化鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖、磷酸吡哆醛、維生素B?12，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鋰、亞碲酸鉀、萘啶酮酸、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸鐵銨，上海君川科技有限公司。

THZ?103B恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SPX?100B?Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份公司;UV?2550 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;FE28 pH計(jì)，瑞士梅特勒?托利多公司;TE124S 電子天平，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3?SSSL培養(yǎng)基研制

1.3.1?共增菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制?分別稱取胰酪蛋白胨肉湯30.0 g、麥芽提取物5.0 g、葡萄糖2.5 g、氯化鈉 10 g加入到1 000 mL蒸餾水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.3，滅菌后4℃保藏備用。

1.3.2?共增菌培養(yǎng)基添加成分及配比篩選?以共增菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基為出發(fā)培養(yǎng)基，選取可能的抑制劑和促進(jìn)劑：萘啶酮酸、氯化鋰、亞碲酸鉀、去氧膽酸鈉、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鐵銨、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛、維生素B?12作為添加劑成分。將4種目標(biāo)菌分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，轉(zhuǎn)接2次后用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋，按照102 CFU/mL起始量逐一接種于分別添加了上述10種添加劑各3個(gè)水平的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，作為添加劑篩選組，以不含添加劑的共增菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定A ?600nm值，計(jì)算抑制率。

1.4?營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）配制

分別稱取牛肉浸膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、氯化鈉5.0 g加入到1 000 mL蒸餾水中，混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.4，滅菌后4℃保藏備用。

1.5?4種目標(biāo)菌在SSSL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果驗(yàn)證

按照102CFU/mL起始量，將4種目標(biāo)菌分別接種到100 mL SSSL培養(yǎng)基及NB培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)24 h。分別取4、8、12、16、20、24 h的培養(yǎng)物以平板計(jì)數(shù)瓊脂進(jìn)行計(jì)數(shù)，平行試驗(yàn)10次，NB培養(yǎng)基為對(duì)照組，對(duì)不同時(shí)間的菌體濃度進(jìn)行對(duì)比。

1.6?SSSL培養(yǎng)基的選擇性驗(yàn)證

按照102CFU/mL起始量，將4種目標(biāo)菌和6種非目標(biāo)菌接種于SSSL培養(yǎng)基及NB培養(yǎng)基中，分別在37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6、12 h，測(cè)定培養(yǎng)物的A ?600nm值，平行試驗(yàn)10次，NB培養(yǎng)基為對(duì)照組，觀察目標(biāo)菌與非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 22.0軟件對(duì)4種目標(biāo)菌在SSSL培養(yǎng)基中及在NB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，進(jìn)行顯著性差異分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?共增菌培養(yǎng)基添加成分及配比確定

表1結(jié)果顯示，氯化鋰隨著濃度的增加對(duì)福氏志賀氏菌和單增李斯特菌的抑制作用均加強(qiáng)，而腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)穩(wěn)定，故取氯化鋰的濃度為0.5 g/L。當(dāng)亞碲酸鉀濃度為0.3 mg/mL時(shí)，腸炎沙門

氏菌、福氏志賀氏菌和單增李斯特菌的抑制率超過(guò)了50%，當(dāng)亞碲酸鉀濃度為0.1 mg/mL和0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)4種目標(biāo)菌抑制作用都不明顯，且兩種濃度抑制率無(wú)明顯差異，考慮到亞碲酸鉀可抑制除凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌外多數(shù)細(xì)菌，故確定亞碲酸鉀濃度為0.2 mg/L。萘啶酮酸對(duì)腸炎沙門氏菌和福氏志賀氏菌抑制作用非常強(qiáng)烈，而檸檬酸鈉對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用非常強(qiáng)烈，故不考慮添加。當(dāng)去氧膽酸鈉濃度為0.3 g/L時(shí)，對(duì)單增李斯特菌的抑制率超過(guò)了50%，當(dāng)濃度為0.5 g/L時(shí)對(duì)黃金色葡萄球菌的抑制率超過(guò)了50%，當(dāng)濃度為0.1 g/L時(shí)對(duì)4種目標(biāo)菌都較為溫和。當(dāng)檸檬酸鐵銨濃度為 1.0 g/L時(shí)，對(duì)志賀氏菌的抑制率超過(guò)了50%，當(dāng)濃度為2.0 g/L時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率超過(guò)了50%，故確定檸檬酸鐵銨添加濃度為0.5 g/L。丙酮酸鈉、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛和維生素B?12對(duì)目標(biāo)菌增菌都有促進(jìn)作用。丙酮酸鈉的促進(jìn)作用隨著濃度的提高而提高;當(dāng)谷氨酰胺濃度為1.0 g/L時(shí)，有一定的抑制作用，可能與谷氨酰胺降解產(chǎn)生過(guò)多的游離氨抑制微生物生長(zhǎng)有關(guān);磷酸吡哆醛隨著濃度的增加，促進(jìn)作用無(wú)明顯增加;維生素B?12隨著濃度增加，促進(jìn)作用變小，故確定丙酮酸鈉濃度為4.0 g/L、谷氨酰胺濃度為0.5 g/L、磷酸吡哆醛濃度為1.0 mg/L、維生素B?12濃度為1.0 mg/L。SSSL培養(yǎng)基配方確定為胰酪胨大豆肉湯30.0 g、麥芽提取物5.0 g、葡萄糖2.5 g、谷氨酰胺0.5 g、丙酮酸鈉4.0 g、磷酸吡哆醛1.0 mg、維生素B?121.0 mg、氯化鈉10 g、氯化鋰0.5 g、亞碲酸鉀0.2 mg、去氧膽酸鈉0.1 g、檸檬酸鐵銨0.5 g、蒸餾水1 000mL。

2.2?4種目標(biāo)菌在SSSL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果的驗(yàn)證

腸炎沙門氏菌在SSSL培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的增菌速度優(yōu)于NB培養(yǎng)基對(duì)照組，相比對(duì)照組增菌效果明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且在20 h兩種培養(yǎng)基中的菌液濃度都達(dá)到了最高值（表2）。

福氏志賀氏菌相比NB培養(yǎng)基對(duì)照組有一定滯后性，整體落后于NB培養(yǎng)基對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但當(dāng)增菌時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)福氏志賀氏菌在兩種培養(yǎng)基中菌液濃度都達(dá)到了10?8CFU/mL，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

金黃色葡萄球菌在兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h以后，每4 h增菌速度明顯優(yōu)于NB培養(yǎng)基對(duì)照組，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在SSSL培養(yǎng)16 h后達(dá)到菌液濃度最高值，比NB培養(yǎng)基提前了4 h，說(shuō)明SSSL更有利于金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)（表4）。

單增李斯特菌在SSSL培養(yǎng)基培養(yǎng)與NB培養(yǎng)基對(duì)照組生長(zhǎng)速度比較相似，但在4、12、16 h單增李斯特菌在SSSL培養(yǎng)基中增菌效果要低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表5）。

2.3?SSSL培養(yǎng)基上選擇性增菌效果的驗(yàn)證

腸炎沙門氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均能在SSSL培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)情況略好于NB培養(yǎng)基對(duì)照組，同時(shí)非目標(biāo)菌受到了抑制，其中蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌和小腸耶爾森菌完全不能生長(zhǎng)，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和副溶血弧菌在培養(yǎng)6 h和12 h受到了強(qiáng)烈抑制，非目標(biāo)菌濃度遠(yuǎn)低于目標(biāo)菌，降低了非目標(biāo)菌對(duì)目標(biāo)菌檢測(cè)的干擾。NB培養(yǎng)基為對(duì)照（表6）。

3?討論

微生物前增菌是影響微生物檢測(cè)的重要因素，而微生物培養(yǎng)基為微生物提供了生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適合的環(huán)境條件，所以國(guó)內(nèi)不少學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了對(duì)不同目標(biāo)菌的增菌培養(yǎng)基研究，范媛媛等[12]對(duì)法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推出的沙門氏快速檢測(cè)AFRON改良法所用到的SX2液體培養(yǎng)基進(jìn)行了評(píng)價(jià)，鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)率達(dá)到了0.94，而非目標(biāo)菌大腸埃希桿菌的最高濃度為3CFU/mL，SX2液體培養(yǎng)基能快速促進(jìn)目標(biāo)菌生長(zhǎng)，又能明顯抑制非目標(biāo)菌生長(zhǎng)。趙廣英等[13]用多種蛋白胨和酵母浸膏作為促進(jìn)副溶血性弧菌增長(zhǎng)的添加成分，得到了新的副溶血性弧菌增菌培養(yǎng)基。李曉琍等[14]通過(guò)金黃色葡萄球菌在Baird?Parker瓊脂平板上生長(zhǎng)效果評(píng)價(jià)對(duì)7.5%氯化鈉肉湯和10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯兩種增菌培養(yǎng)基進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯選擇性增菌效果更好。

本研究通過(guò)以改良的胰蛋白胨大豆肉湯為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加了丙酮酸鈉、谷氨酰胺、磷酸吡哆醛、維生素B?12促進(jìn)生長(zhǎng)成分，4種目標(biāo)菌在選擇性增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)8h后，菌體濃度能達(dá)到105～106 CFU/mL，培養(yǎng)12 h后，菌體濃度能達(dá)到107～108 CFU/mL。目標(biāo)菌在SSSL培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度總體上優(yōu)于在營(yíng)養(yǎng)肉湯NB培養(yǎng)基上，能滿足后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)要求。同時(shí)為了較好地抑制背景微生物，添加了氯化鋰、亞碲酸鉀、去氧膽酸鈉和檸檬酸鐵銨使非目標(biāo)菌表現(xiàn)為完全不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)受到抑制，保證了SSSL培養(yǎng)基的選擇性。

下一步可以探討微生物培養(yǎng)基對(duì)于菌體的損傷修復(fù)和抑菌成分的拮抗，因?yàn)槭称分械奈⑸锿艿郊庸み^(guò)程中高溫和低溫的損傷，殘留抗生素和抑菌化學(xué)成分的損傷，這些容易導(dǎo)致食源性致病微生物處于休克和假死狀態(tài)，導(dǎo)致檢測(cè)的檢不出或結(jié)果的假陰性[15]。今后可以考慮把菌體細(xì)胞壁損傷的修復(fù)和本課題專注的快速增菌和抑菌成分吸附兩個(gè)方面結(jié)合起來(lái)，從三個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行一體化研究，為食源性致病微生物各種檢測(cè)方法提供更簡(jiǎn)便快捷的多場(chǎng)景通用型增菌培養(yǎng)基?！?/p>

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Preparation of Selective Co?enrichment Medium for Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogenes

YAN Li1，XIAO Wen1，GUO Kun?peng1，HE Juan1，LIU Zhuo?ling2，YU Zheng2

（1 Hunan Institute of Food Quality Supervision and Inspection，Changsha 410117，China;2 Cooperative Innovation Center of Jiangnan University，Wuxi 214100，China）

Abstract：?Objective To develop a selective co?culture medium（SSSL）for Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogens. Method Single factor experiments were conducted to determine the composition and proportion of SSSL medium，and plate counting method was used to verify the bacteriostasis effect of SSSL medium. Result The SSSL medium formulation was established.After 8 hours of culture in SSSL medium，the concentration of target bacteria reached 105～106 CFU/mL，and the growth of non?target bacteria was inhibited. Conclusion SSSL medium can be used for selective co?growth of Salmonella，Staphylococcus aureus，Shigella and Listeria monocytogenes.It is expected that SSSL medium can be combined with various detection methods to improve the detection rate and accuracy.

Keywords：Salmonella;Staphylococcus aureus;Shigella;Listeria monocytogenes;co?enriched;selective medium