祝清燦

【摘 要】 目的： 建立豬毛蒿精油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法： 采用TLC法對豬毛蒿精油進(jìn)行定性鑒別;采用氣相色譜法測定精油中丁香酚的含量。結(jié)果： 薄層色譜法斑點(diǎn)明顯，分離度好。丁香酚進(jìn)樣量在0.04656～0.4656 μg范圍內(nèi)與峰面積值具有良好的線性關(guān)系，r=0.99999，平均加樣回收率為101.2%，RSD為1.9%（n=6）。結(jié)論： 建立的方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、可靠，重現(xiàn)性好，可用于豬毛蒿精油的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 豬毛蒿精油;薄層色譜;氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用;丁香酚

【中圖分類號】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）13-0039-05

Abstract：Objective To establish the quality standard of Artemisiae Scopariae Oil.Methods The TLC method was used to qualitatively identify Artemisia Scoparia Oil.GC-MS was used to determine Eugenol.Results Thin layer chromatography was clear with good separable degree.The linera range for Eugenol was 0.04656～0.4656 μg，（r=0.9999）.The average recovery was 101.2%，RSD was 1.9%.Conclusion The established methods were accurate， reliable， reproducible and can be used for the quality control of Artemisia Scoparia Oil.

Keywords：Artemisia Scoparia Oil;TLC;GC-MS; Eugenol

豬毛蒿為菊科植物豬毛蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.的地上部分，經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取得豬毛蒿精油。豬毛蒿精油為淺黃色至棕黃色澄清液體，有特異香氣，味微辛，據(jù)文獻(xiàn)[1-4] 報(bào)道， 對真菌有很強(qiáng)的抑制作用，藏族地區(qū)民間常用于治療手、足癬等皮膚病，是藏藥婦潔搽劑[5]的主要成分之一。豬毛蒿精油化學(xué)成分以單萜為主（80.74%），主要成分有丁香酚、桉葉素、檸檬烯、β-丁香烯、α-蒎烯、β-蒎烯等[6-8]。丁香酚是豬毛蒿精油中的主要成分，具有麻醉、抗菌防腐、殺蟲、解熱、降溫、抗性氧化、抗衰老等藥理作用 [9]。Pinto等 [10]研究發(fā)現(xiàn)丁香酚不僅對皮膚癬菌屬和曲霉菌屬具有抗菌活性，而且對氟康唑有天然耐藥的克柔念株菌和易誘導(dǎo)耐藥的光滑念珠菌均表現(xiàn)出較高的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌等12種細(xì)菌具有較好的抗菌作用 [11-12]。

丁香酚存在于豬毛蒿精油中，是一種極具開發(fā)潛力的活性成分。為了控制豬毛蒿精油產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法進(jìn)行豬毛蒿精油鑒別，采用氣相色譜法（GC—MS聯(lián)用）對豬毛蒿精油中的丁香酚進(jìn)行含量測定，為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

安捷倫6890A-5973氣質(zhì)聯(lián)用儀，AB104-N電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），ZF-I三用紫外分析儀，YOKO-ZS薄層色譜成像儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)）。

丁香酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110725-201414），豬毛蒿精油對照提取物（中國食品藥品檢定研究院，批號：610007-201501），豬毛蒿由青海省食品藥品檢驗(yàn)所楊鳳梅主任鑒定，化學(xué)試劑為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），硅膠G預(yù)制板（德國默克公司生產(chǎn)，批號HX242369）。

豬毛蒿精油樣品（批號為20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106），由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 鑒別 取本品100 mg，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取豬毛蒿油對照提取物，同法制成對照提取物溶液。再取丁香酚對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含5 μL的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[13]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（130∶ 70∶ 7）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照提取物和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（A）。置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照提取物和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（B）。結(jié)果如圖1所示。

2.2 丁香酚含量的GC法測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：TR-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，膜厚0.25 μm）;載氣為高純氮?dú)?，純?99.999%。流速1.5 mL·min-1;柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以每分鐘5 ℃的速率升溫至140 ℃，再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃，保持3 min;進(jìn)樣口溫度為220 ℃;檢測器為240 ℃;分流進(jìn)樣，分流比為10∶ 1。理論板數(shù)按丁香酚峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。如圖2所示。

在上述條件下，在圖2-A中，對照品丁香酚的峰出現(xiàn)在tR8.99，在圖2-B中，出現(xiàn)與對照品丁香酚保留時間相似的峰tR 8.99，應(yīng)為樣品中的丁香酚，且與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離。

2.2.2 對照品溶液制備 取丁香酚對照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為測定用對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品約0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 對豬毛蒿油供試品溶液進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析，具體參數(shù)如下：色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;載氣為高純氦氣，純度>99.999%。流速1.2 mL·min-1;柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以每分鐘10 ℃的速率升溫至240 ℃，保持4 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;檢測器為260 ℃;分流進(jìn)樣，分流比為10∶ 1。電離方式：EI;離子源溫度：230 ℃;連接線溫度：280 ℃;四級桿溫度：150 ℃。結(jié)果：分子離子峰的質(zhì)荷比為164.1，保留時間（9.96）與丁香酚峰相似，其裂解與丁香酚相同，豬毛蒿精油供試品中丁香酚峰質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫（安捷倫Chemstation色譜工作站NIST MS Search 2.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫）中丁香酚的質(zhì)譜圖匹配度為98%，其特征離子為77、103、149和164（其中164為定量離子），且對應(yīng)質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與標(biāo)準(zhǔn)一致，其豐度比偏差在規(guī)定范圍內(nèi)，因此可認(rèn)為是同一物質(zhì)。如圖3、圖4所示。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取丁香酚對照品0.04656g（含量按100.0%計(jì)算），置50mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，濃度為931.2 μg·mL-1。精密吸取對照品儲備液，用乙酸乙酯稀釋配制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為： 46.56、93.12、186.2、232.8、465.6 μg·mL-1。分別精密吸取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，按照“2.2.1色譜條件”測定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），線性回歸方程為：Y= 12599767.5X –23282.6（r =0.99999）。結(jié)果表明：丁香酚進(jìn)樣量在0.04656～0.4656 μg范圍內(nèi)與峰面積值具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號20180906），分別于0、1、2、4、10 h測定其峰面積，按上述色譜條件測定，結(jié)果供試品丁香酚峰面積的RSD=1.7%。表明制備的供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號20180906）精密稱取0.1 g，各6份，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測定，結(jié)果丁香酚含量的平均值為：52.52 mg·g-1，RSD為1.6%，說明試驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取丁香酚對照品0.04656g（含量按100.0%計(jì)算），置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，備用（含丁香酚0.9312 mg·mL-1）。

取同一批號樣品（批號20180906，含丁香酚為52.52 mg·g-1）各6份，每份約0.05 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別精密加入回收對照溶液3 mL，按含量測定的方法制備回收用供試品溶液并測定含量，計(jì)算丁香酚的平均回收率為101.2%。結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品的測定 ?取20160704、20160801、20170906、20171114、20180701、20180702、20180906、20181104、20181105、20181106共10批樣品，照上述含量測定方法測定丁香酚含量，結(jié)果分別為：60、71、52、63、81、62、65、76、87、48mg·g-1。平均值為66.5mg·g-1，最低值為48mg·g-1。

經(jīng)過上述方法學(xué)驗(yàn)證和耐用性試驗(yàn)考察，結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)的色譜條件對丁香酚的定量測定專屬性高、重現(xiàn)性好、分離能力強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便。

3 討論

3.1 薄層色譜法供試品制備 比較了供試品乙酸乙酯、丙酮和三氯甲烷溶解，以乙酸乙酯為溶劑制備供試品溶液分離度較好，斑點(diǎn)清晰。

3.2 薄層色譜條件選擇 曾采用環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（130∶ 70∶ 7）、石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（9∶ 1）、苯-丙酮（19∶ 1）等展開劑進(jìn)行分離，結(jié)果表明以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（130∶ 70∶ 7）分離效果最好，特征斑點(diǎn)清晰。

3.3 丁香酚含量測定研究 采用GC—MS聯(lián)用技術(shù)，比僅采用氣相色譜法測定含量提高了可靠性和準(zhǔn)確性。分別比較了正己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚（30～60 ℃）為提取溶劑的丁香酚含量結(jié)果，結(jié)果表明：以乙酸乙酯作為供試液溶劑，樣品中丁香酚溶解完全，測得含量較高，故最終選用乙酸乙酯為溶劑。

3.4 氣相色譜法耐用性考察 采用不同的進(jìn)樣口溫度（210 ℃、220 ℃、230 ℃）、不同的檢測器溫度（230 ℃、240 ℃、250 ℃）和不同的柱溫（70 ℃、80 ℃、90 ℃）及不同品牌和長度的色譜柱（TR-5，30 m×0.32 mm，0.25 μm和HP-5，25 m×0.32 mm，0.17 μm）進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察。結(jié)果表明，在不同的進(jìn)樣口溫度、不同的檢測器溫度、不同的柱溫及不同品牌的色譜柱的小范圍變動情況下具有耐用性，均可準(zhǔn)確檢出丁香酚。

豬毛蒿精油中有較高含量的抑菌有效成分丁香酚，廣泛應(yīng)用于臨床及工業(yè)化中藥制劑的生產(chǎn)，因此，建立豬毛蒿精油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制精油質(zhì)量顯得尤為重要，筆者的研究結(jié)果為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2020-03-11 編輯：陶希睿）