孟 迪， 張力元， 江 威， 楊小鳳， 廖祥儒*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122）

磷是一種重要的不可再生資源，在植物生長發(fā)育過程中起著不可缺少的作用[1]。 但磷大多以不可溶形式存在于土壤中，無法滿足植物生長對磷的需求，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常采用追加磷肥的方法來補(bǔ)足土壤中的磷。 然而磷肥一經(jīng)施放到土壤中，很容易被土壤中的金屬離子固定化，變成難溶狀態(tài)，使磷肥中的磷素難以發(fā)揮到最高利用價值。 研究表明，磷肥施用后僅一部分可溶磷（20%～30%）被植物吸收，絕大部分磷肥由于土壤的固定化無法被植物利用，造成了磷資源的極大浪費[2]。 因此提高土壤中難溶磷物質(zhì)的利用效率， 緩解磷資源危機(jī)具有重要意義，同時也是推進(jìn)“資源節(jié)約型，環(huán)境友好型”社會的必然要求。

貝殼屬于天然礦物材料， 主要成分為碳酸鈣（95%），其余為有機(jī)質(zhì)（鈣、鎂、鋅、鐵、磷等）[3]。 根據(jù)《2013年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，2012年全國貝類總產(chǎn)量為1208.44 萬噸，江蘇產(chǎn)量為68.2 萬噸，占江蘇水產(chǎn)總產(chǎn)量75.4%[4]。 在貝類豐產(chǎn)地區(qū)，大量的貝殼由于降解周期長， 沒有得到合適處理而大量堆積，不僅占用土地資源。 同時由于貝殼有機(jī)質(zhì)腐爛，造成了一系列的環(huán)境污染[5]。 傳統(tǒng)處理貝殼資源的方法是將貝殼粉作為一種重要的鈣源，建筑填充材料，污染處理材料以及催化介質(zhì)[6]，但存在加工成本及運輸成本過高的缺點，且貝類資源豐富，應(yīng)積極開發(fā)新用途。 因此，如何合理地利用貝殼資源，提高貝殼資源利用率和性價比，減少貝殼對于環(huán)境造成的污染等問題亟待解決。 研究表明將貝殼資源作為土壤改良劑日益得到重視，其加入土壤后的主要作用為調(diào)節(jié)pH，提高微生物的生理性能，并有一定的去除重金屬離子的作用[7]。

基于磷消耗量增長以及全球磷源儲備的日益缺乏，開發(fā)新的磷源物質(zhì)尤為重要。 近年來，利用解磷微生物的生物方法逐漸被研究[8]。 解磷菌是一類能促進(jìn)不溶磷物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的可溶磷物質(zhì)的微生物，在提高植物對磷的吸收和作物增產(chǎn)中具有重要作用[9]。 關(guān)于解磷微生物的研究，目前主要集中在芽孢桿菌屬 （Bacillus）， 假單胞菌屬（Pseudomonas）， 青 霉 屬 （Penicillium）， 曲 霉 屬（Aspergillus） 等[9]。 如Bacillus megateriumA6[10]，Pseudomonas putidaGR12-2[11]，Aspergillus Niger[12]，Streptomycessp. CTM396[13]對含磷物質(zhì)均表現(xiàn)出顯著的溶磷作用。

為進(jìn)一步豐富解磷微生物的種類，提高土壤中難溶磷物質(zhì)的利用率。 作者從貴州磷礦上生長的植物根際，篩選得到一株高效解磷的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensYP6，對其進(jìn)行16S rRNA鑒定， 并探究YP6 的部分促生特性。 首次考察了YP6 菌株對貝殼粉及土壤的溶磷作用，為提供一種新型微生物磷肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

貴州磷礦上生長的植物。 貝殼粉（牡蠣粉，生蠔粉，蛤蜊粉）均來自浙江臺州（表1）。 細(xì)菌基因組提取試劑盒， 購自上海生工公司；16S rRNA 基因測序由上海生工完成。 其他試劑為國產(chǎn)分析純。

表1 3 種貝殼粉中無機(jī)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Inorganic components and contents in three shell powders %

1.2 菌株的篩選

植物根經(jīng)過修剪， 加入三角瓶用無菌水震蕩，稀釋后，涂布在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基（葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，羥基磷灰石10 g，酵母粉0.4 g，瓊脂20 g；pH 7.0）平板上30 ℃培養(yǎng)2 d，挑選產(chǎn)明顯透明圈的菌株并用甘油管保存，在以質(zhì)量濃度2 g/dL 磷礦粉為磷源的無機(jī)磷液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)2 d。以不接種菌株的培養(yǎng)基為對照，用鉬酸銨比色法[14]檢測樣品中有效磷的質(zhì)量濃度，并根據(jù)該方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 菌株進(jìn)行復(fù)篩后，提取解磷能力最高菌株的16S rRNA 進(jìn)行菌種鑒定， 提交NCBI 比對， 并用MEGA 5.0 軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菌株的促生能力

菌株在含有2 g/dL 磷礦粉的LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)1～5 d，以不加菌株的樣品為對照，每天取樣，分別檢測樣品中有效磷增加量，磷酸酯酶活性（磷酸苯二鈉比色法[15]），生長素質(zhì)量濃度[16]以及鐵載體的濃度[17]。

1.4 菌株對3 種貝殼粉的促磷作用

菌株在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h 達(dá)到對數(shù)期后，接種于含有2 g/dL 貝殼粉的LB 培養(yǎng)基中，以不接種菌株的培養(yǎng)基為對照，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)1～7 d，樣品5000 g 離心5 min 后，用鉬酸銨比色法檢測體系中的可溶磷質(zhì)量濃度。

1.5 菌株對貝殼粉和土壤混合物的促磷作用

將3 mL 菌株分別接種于10 g 滅菌土壤和10 g貝殼粉與土壤混合物（加入無菌水適當(dāng)濕潤），以接種3 mL 無菌水為對照， 混合均勻后自然環(huán)境下培養(yǎng)1～7 d，取等量樣品用無菌水稀釋，5000 g 離心5 min 后，測量體系中的磷質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

有效磷質(zhì)量濃度測定：

標(biāo)準(zhǔn)曲線（1（a）），線性擬合方程（1）如下：

式（1）中，A 為有效磷質(zhì)量濃度（mg/L）；C 為在OD700下樣品的吸光度值。

鐵載體（DHB）濃度測定：

標(biāo)準(zhǔn)曲線（1（b）），線性擬合方程（2）如下：

式（2）中，A 為鐵載體濃度（μmol/L）；C 為在OD510下樣品的吸光度值。

生長素（IAA）質(zhì)量濃度測定：

標(biāo)準(zhǔn)曲線（1（c）），線性擬合方程（3）如下：

式 （3） 中，A 為生長素質(zhì)量濃度 （μg/mL）；C 為在OD550下樣品的吸光度值。

各種促生特性檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 菌株的篩選與鑒定

實驗從樣品中篩選到11 株具有明顯溶磷圈的菌株， 并考察了11 株菌株的溶磷能力。 如圖2 所示， 在以磷礦石為唯一磷源的培養(yǎng)基中，YP6 表現(xiàn)出最高的溶磷能力，達(dá)到109.3 mg/L。由于磷礦粉的加入，對照中存在少量有效磷（23.7 mg/L），經(jīng)計算，YP6 作用的樣品中溶解了的磷質(zhì)量濃度是對照的4.6 倍，遠(yuǎn)高出其他菌株的溶磷能力。 因此選取YP6作為所要研究的目的菌株。

圖1 各種促生特性檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curves for the detection of various growth promoting characteristics

提取YP6 的全基因組序列進(jìn)行16S rRNA 序列擴(kuò)增， 將測序結(jié)果提交至NCBI， 獲得序列號為KP326355.1。對YP6 的16S rRNA 進(jìn)行序列比對，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹圖3。 經(jīng)比較，YP6 與BacillusamyloliquefaciensXH7（登錄號：CP002927.1）的16S rRNA 序列達(dá)到99%的相似度， 因此將YP6 命名為Bacillus amyloliquefaciens YP6。

圖2 11 株芽孢桿菌的溶磷能力比較Fig. 2 Comparison of phosphorus solubilizing ability of 11 strains of Bacillus

圖3 基于進(jìn)化樹16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.3 YP6 的促生作用

如圖4 所示YP6 的促生特性，有效磷質(zhì)量濃度和堿性磷酸酯酶酶活均隨時間上升，成正相關(guān)。 其中有效磷質(zhì)量濃度在第5 天達(dá)到135.43 mg/L，其增長量約為110.31 mg/L。YP6 也具有較強(qiáng)的分泌生長素和鐵載體的能力，其生長素質(zhì)量濃度和鐵載體濃度分別在第3 天和第2 天達(dá)到最高， 分別為28.62 μg/mL 和8.09 μmol/L。

圖4 YP6 的促生特性Fig. 4 Growth promoting characteristics of YP6

2.4 YP6 對貝殼粉的溶磷作用

貝殼粉經(jīng)YP6 作用7 d 后，結(jié)果如圖5 所示。 3組對照中顯示，貝殼粉和培養(yǎng)基中均存在少量可溶磷，但隨著時間增長質(zhì)量濃度并無明顯變化，質(zhì)量濃度分別約為9.2、11.4、5.8 mg/L。 不同貝殼粉中含有的不溶磷質(zhì)量濃度不同，因此釋放的可溶磷質(zhì)量濃度也有區(qū)別。 3 種貝殼粉經(jīng)YP6 菌株作用隨時間增長可溶磷的質(zhì)量濃度成正相關(guān)。 其中牡蠣粉中有效磷質(zhì)量濃度最高，達(dá)到44.9 mg/L，生蠔粉中次之，為40.3 mg/L，蛤蜊粉中最少，為39.2 mg/L，可溶磷質(zhì)量濃度分別是相應(yīng)對照的5.0、3.4、6.7 倍。結(jié)果表明YP6 對貝殼粉具有明顯的溶磷作用，可有效將貝殼粉中的不溶磷轉(zhuǎn)化為可溶磷釋放出來。

2.5 菌株對貝殼粉和土壤混合物的溶磷作用

圖5 YP6 對貝殼粉的促磷作用Fig. 5 Phosphorus solubilization of YP6 for mussel powders

如圖6 示，對照組中沒有菌株的作用，可溶磷質(zhì)量濃度較低， 隨時間變化質(zhì)量濃度并無明顯變化， 其可溶磷可能來源于土壤和培養(yǎng)基， 約為8.4 mg/L。 經(jīng)菌株作用的試驗組中，隨時間增長釋放的溶磷量增加，在第6 天達(dá)到穩(wěn)定，不再有明顯增加，可溶磷質(zhì)量濃度為34.9 mg/L， 提高至原來的4.2倍。 結(jié)果說明，YP6 可有效將土壤中的不溶磷釋放出來，進(jìn)而提高磷的利用效率。

圖6 YP6 對土壤的促磷作用Fig. 6 Phosphorus solubilization of YP6 for soil

圖7 表示通過研究在YP6 作用下，貝殼粉和土壤混合物中的可溶磷質(zhì)量濃度，來提高土壤中磷的利用效率，同時驗證貝殼粉是否能作為一種新型磷肥用以施加入土壤中。 同樣，未加入菌株的對照樣品中可溶磷質(zhì)量濃度隨時間變化未呈現(xiàn)明顯變化，來源于混合物中有效磷的質(zhì)量濃度分別為16.5、19.9、13.3 mg/L。 通過YP6 的促磷作用，實驗組樣品中的可溶磷質(zhì)量濃度顯著上升， 在第7 天達(dá)到86.4、73.1、74.8 mg/L，是對照組的5.2、3.7、5.6 倍。 3組試驗中，混入牡蠣粉的實驗組有效磷質(zhì)量濃度在第7 天最高， 在第7 天有效磷的增長均呈下降趨勢， 混入蛤蜊粉和生蠔粉的實驗組在5 d 后增長趨勢并不明顯，這與培養(yǎng)基的消耗以及菌株的死亡有關(guān)。

圖7 YP6 對土壤和貝殼粉混合物的促磷作用Fig. 7 Phosphorus solubilization of YP6 for the mixtures of soil and mussel powders

2.6 討論

我國磷資源總體呈現(xiàn)豐而不富的現(xiàn)狀，隨著磷礦大量開采，磷資源愈將匱乏，與此對應(yīng)的是磷資源利用率低，大量被固定化，未能被植物吸收利用。針對土壤中磷含量豐富但有效磷缺乏，開發(fā)與利用解磷微生物是非常有效的環(huán)境友好型手段。20 世紀(jì)80年代開始， 利用微生物溶磷作用的研究越來越多。 Xiao 等從湖北磷礦篩選得到3 株解磷菌（Candidakrissii，Penicilliumexpansum，Mucorramosissimus），并優(yōu)化了其溶磷條件[18]。 Vassilev 等發(fā)現(xiàn)Aspergillus niger的加入可有效增加有效磷的含量并促進(jìn)植物的生長[19]。 Mendes Gde 等固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化Aspergillus niger的溶磷條件，并將發(fā)酵產(chǎn)物作為磷肥施用于土壤中，促進(jìn)了植物的生長及植物對磷的吸收[20]。 實驗從貴州磷礦的植物根際篩選得到一株解磷菌YP6， 發(fā)現(xiàn)YP6 具有良好的促生特性，適合用作土壤改良菌株。 在以2 g/dL 磷礦石為唯一磷源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d， 有效磷質(zhì)量濃度達(dá)到109.3 mg/L，可溶磷質(zhì)量濃度提高至4.6 倍。 YP6 應(yīng)用到土壤中也展現(xiàn)出良好的溶磷能力，土壤中被固定化的含磷物質(zhì)被釋放成可被植物吸收的有效磷，可溶磷質(zhì)量濃度提高至4.2 倍。 結(jié)果表明YP6 具有通過溶解含磷物質(zhì)，釋放有效磷的能力，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)以及肥料中。

貝殼是海產(chǎn)養(yǎng)殖的副產(chǎn)物， 難以自然降解，其利用不充分，對環(huán)境污染嚴(yán)重，目前已成為世界性難題。 貝殼同時作為一種成本低廉的自然資源，具有巨大的潛在價值。 Boey 等和Hu 等分別將海扇殼和河蚌殼作為生產(chǎn)CaO 的原材料，用以催化反應(yīng)生產(chǎn)柴油[21-22]。 趙宏等以貝殼粉為原材料制備帶狀羥基磷灰石[23]。凡軍民等發(fā)現(xiàn)，在金針菇栽培材料中添加貝殼粉，能有效提高子實體產(chǎn)量[24]。 Chang 等發(fā)現(xiàn)，將牡蠣粉施加入土壤后，可有效改善土壤的理化性質(zhì)以及土壤中微生物的特性，調(diào)節(jié)土壤中pH，并使洋白菜增產(chǎn)[25]。 曹英蘭等發(fā)現(xiàn)，牡蠣粉的加入，將土壤pH 調(diào)節(jié)到7.74，有效矯正了土壤的弱酸性，并降低了土壤中重金屬鎘的含量[26]。 El-Azeem 等通過研究牡蠣殼， 蛋殼和蛤貝等廢棄物對土壤中Cd、Pb 和As 的修復(fù)能力， 發(fā)現(xiàn)土壤中pH 提高明顯，Cd、Pb 和As 的含量顯著下降[27]。 Paz-Ferreiro 等發(fā)現(xiàn)，貝殼粉與泥漿混入土壤中，可改善土壤pH 并檢測了土壤性能，提出貝殼粉的添加有望改善土壤肥力[28]。

3 結(jié) 語

本實驗中，通過驗證YP6 對牡蠣粉、蛤蜊粉和生蠔粉同樣具有釋放有效磷的能力后，將YP6 應(yīng)用于土壤和貝殼粉混合物中，可溶磷質(zhì)量濃度隨時間增長逐漸上升， 在第7 天3 種樣品中分別達(dá)到86.4、73.1、74.8 mg/L，是對照組的5.2、3.7、5.6 倍。其中，牡蠣粉中釋放的可溶磷最高，接近YP6 作用下的磷礦石中有效磷質(zhì)量濃度。 由于不同貝殼粉中含磷物質(zhì)存在差異，YP6 對3 種貝殼粉的解磷效率仍需進(jìn)一步實驗。 但該數(shù)據(jù)說明，YP6 可有效提高貝殼粉和土壤中有效磷質(zhì)量濃度，貝殼粉有望替代磷礦石作為新的磷肥原料，或作為補(bǔ)充劑加入磷肥之中來緩解我國目前面臨的磷礦資源緊張現(xiàn)狀。 同時，作為一種貝殼資源回收利用的新方法，也大大減少了貝類資源的污染和浪費。

盡管解淀粉芽孢桿菌YP6 對土壤和貝殼粉具有顯著的解磷作用，其解磷機(jī)制，最佳解磷條件仍不明確。 有研究報道，解磷微生物的解磷能力是由于微生物產(chǎn)生的有機(jī)酸（如檸檬酸，草酸，鐵載體等）[29]或者微生物分泌的酶（如植酸酶、磷酸酯酶）[30]。 因此，YP6 的解磷機(jī)制仍需進(jìn)一步的實驗來確定。 同時，其促生能力能否促進(jìn)植物的生長，有效磷能否被植物有效吸收仍有待在實際應(yīng)用中進(jìn)行更加深入的研究。