林 聰，黃曉松，易艷輝，李 萍，楊 瑩，李遠紅，劉柳青

湖南省腦科醫(yī)院神經內科(長沙 410008)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)屬于一種慢性疾病，主要是一系列腦血管疾病因素所致的腦組織、腦循環(huán)出現(xiàn)障礙的一種智能損害綜合癥[1]，臨床表現(xiàn)主要為認知功能障礙，嚴重威脅著患者的身心健康[2-3]。氧化應激(Oxidative stress,OS)主要是因為機體出現(xiàn)氧化與抗氧化失衡現(xiàn)象，導致?lián)p傷了組織、細胞的氧化，其在血管性癡呆發(fā)生與發(fā)展的各環(huán)節(jié)中都發(fā)揮重要作用[4-5]。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因是一個原癌基因，可抑制神經元凋亡和壞死，也可促進神經元的存活以及突觸的再生[6-7]。Bcl-2表達增加可能對腦缺血后的神經細胞起到保護作用[8]。血管性癡呆屬于祖國醫(yī)學的“呆病”范疇，基本病機為痰蒙心神、髓海不足、血瘀痹阻及虛火上擾，屬于本虛標實的一種疾病[9-10]。中醫(yī)治療該病，在延緩病情進展、改善患者全身癥狀等都有一定的療效，主要治法為除濕化痰、理氣活血、補腎填髓、活血化痰等[11]。本文具體探討了活血化痰膠囊對血管性癡呆大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達的影響，希望為中醫(yī)臨床制定合理的治則、治法奠定基礎。

材料與方法

1 實驗材料 SPF級成年雄性Sprague Dawley大鼠60只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物許可證編號00010751)。4～5周齡，體重140～160 g。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度在22 ℃～24 ℃，相對濕度40%～60%，飲食、飲水自由，12/12 h光照黑暗循環(huán)。安理申(鹽酸多奈哌齊片，國藥準字H20070181，規(guī)格5 mg/片)?；钛的z囊(國藥準字Z20100045)為當前臨床上治療老年性癡呆的經驗方，由熟地、山萸肉、川斷、田七、枸杞、淫羊藿、首烏、鎖陽等組成，膠囊3 g/粒。MT-200 Morris水迷宮購自成都泰盟科技有限公司，抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體都購自北京中杉金橋生物有限公司。

2 實驗方法

2.1 血管性癡呆大鼠模型的建立：采用雙側頸動脈缺血再灌注法制作血管性癡呆模型，碘伏消毒大鼠頸部并固定，從大鼠頸正中縱行1.5 cm 的切口，切開皮膚后，逐層鈍性分離皮下組織及肌肉等，暴露大鼠雙側頸總動脈。雙結扎手術線的兩側頸總動脈近心端、遠心端部位，縫合皮膚，常規(guī)抗生素預防感染。建模成功標準：大鼠無明顯的肢體運動障礙，但是出現(xiàn)輕微的反應遲鈍，精神萎靡。

2.2 實驗動物分組與處理：將建模成功的54只大鼠(6只大鼠造模不成功的原因包括死亡、嚴重感染等)隨機分三組即模型組、西藥組與中藥組，各18只。西藥組與中藥組分別給予多奈哌齊3 g灌胃與活血化痰膠囊3 g灌胃(灌胃量為1 ml/100 g體重)，模型組以等劑量的生理鹽水代替。三組給藥時間都為21 d。大鼠灌胃時，右手持灌胃注射器，左手拇指和食中二指相對，抓住大鼠頸部皮膚，使大鼠的頭部和頸部及軀干呈一直線。大鼠的灌胃針長8 cm，直徑1.2 mm。

2.3 觀察指標：①在給藥后7、14、21 d進行Morris水迷宮實驗，通過計算機對大鼠從入水開始，直到跳上平臺這一段時間進行記錄，從而確定逃避潛伏期時間，若2 min內大鼠未找到平臺則記錄為大鼠的逃避潛伏期為2 min。②在給藥后21 d處死所有大鼠，完整取出鼠腦，置于中性甲醛溶液中固定48 h并石蠟包埋，采用HE染色記錄腦組織病理變化情況。同時將其與大腦組織在玻璃勻漿器中研磨成10%勻漿，4 ℃低溫離心10 min，取上層血清，采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法測定組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)與丙二醛(Malondialdehyde，MDA)活性。③取大腦海馬組織的樣本，提取總蛋白，采用Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平，以β-actin作為內標。

結 果

1 各組大鼠逃避潛伏期比較 中藥組、西藥組給藥后7、14、21 d的逃避潛伏期都低于模型組；中藥組也低于西藥組，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后不同時間點逃避潛伏期比較(min)

2 各組大鼠海馬組織形態(tài)學比較 模型組中海馬區(qū)神經元大量變性、死亡，周圍出現(xiàn)空暈，胞漿濃縮，細胞體積縮小，核固縮、碎裂明顯；西藥組中海馬區(qū)神經元變性，神經元胞體縮小，死亡明顯減輕，但形狀與模型組接近；中藥組中海馬區(qū)神經元基本無變形，神經元胞體基本正常，細胞核圓而大，核仁清晰(圖1)。

圖1 各組大鼠的海馬組織形態(tài)學(HE染色，×200)

3 各組大鼠SOD與MDA活性比較 中藥組、西藥組給藥后21 d的SOD活性高于模型組，MDA活性低于模型組，相比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中藥組與西藥組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠造模后21 d腦組織SOD與MDA活性比較

4 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平比較 中藥組、西藥組給藥后21 d的Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平高于模型組，中藥組高于西藥組，相比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠造模后21 d的海馬組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平對比

討 論

血管性癡呆是中老年人群的常見病、多發(fā)病，同時也給患者家庭和社會帶來越來越沉重的負擔[12-14]。中醫(yī)認為血管性癡呆的病位在腦，其本在腎，與臟腑功能失調有關，病性以瘀、火、虛、痰為主，在治療上應以辨證與辨病相結合治療[15-16]。本研究顯示中藥組、西藥組給藥后7、14、21 d的逃避潛伏期均低于模型組，中藥組也低于西藥組。中藥組海馬區(qū)域細胞排列比較緊密，僅見少數(shù)細胞變性、壞死，胞漿內尼氏體比較豐富。表明活血化痰膠囊可顯著改善血管性癡呆大鼠認知水平，提高學習記憶功能，也可緩解海馬神經元損傷[17]。

生理狀態(tài)下，機體的氧化應激狀態(tài)處于平衡狀態(tài)；當血管性癡呆發(fā)生時，導致活性氧堆積[18-19]。SOD是在正常情況下存在于體內的重要自由基天然清除劑，血管性癡呆可使得SOD活性下降，使膜結構受損程度逐步加重。MDA是一種重要的生物大分子交聯(lián)劑，可影響DNA復制與轉錄，導致SOD生成減少與活性降低。本研究顯示中藥組、西藥組給藥后21 d的SOD活性高于模型組，MDA活性低于模型組，中藥組與西藥組比較差異也有統(tǒng)計學意義。當前也有研究表明活血化痰膠囊可增加大鼠的下丘腦神經元鈉鉀電流，增加海馬部位K+介導的乙酰膽堿釋放，從而緩解或減輕了缺血缺氧對神經元的損傷[20-21]。還有研究表明活血化痰藥物的提取物可減輕腦缺血對海馬神經元的損傷，阻止及抑制海馬組織神經元凋亡，從而可避免腦血管疾病患者發(fā)展成血管性癡呆[22-23]。

細胞凋亡機制中Bcl-2屬于非常重要的一種調節(jié)因子，可抑制細胞凋亡[24]。已有研究顯示雌二醇可能通過提高Bcl-2表達水平，減少海馬神經元的凋亡，降低神經元對凋亡刺激的敏感性，達到對神經元的保護作用[25-26]。本研究顯示中藥組、西藥組給藥后21 d的Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平高于模型組，中藥組也高于對照組，提示活血化痰膠囊可能通過提高海馬組織Bcl-2 表達，改善血管性癡呆大鼠的學習記憶功能。本研究也有一定的不足，活血化痰膠囊介導的腦神經保護途徑比較多，本研究只分析了單一途徑；且本研究沒有設置空白對照，可能存在研究偏倚，將在后續(xù)研究中深入分析。

總之，活血化痰膠囊在血管性癡呆大鼠中的應用能促進海馬區(qū)Bcl-2表達，緩解氧化應激反應，促使大鼠具有更好的學習記憶能力。