張永根，崔梓琪，姜 鑫，徐宏建

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

奶牛泌乳早期和高峰期產(chǎn)奶能量需求與日糧供給不平衡，脂肪組織中脂肪酸動(dòng)員增加，易引起肝臟中脂質(zhì)積聚和肝功能受損，影響奶牛健康和泌乳性能。益生菌因具有提高動(dòng)物飼料效率、生產(chǎn)性能和健康水平作用而備受關(guān)注。

益生菌作為一類活性微生物，可調(diào)節(jié)奶牛瘤胃發(fā)酵模式、提高生產(chǎn)性能[1]。乳酸菌作為最常用益生菌，可在奶牛體內(nèi)作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，預(yù)防腸道感染、減緩應(yīng)激反應(yīng)、刺激宿主免疫應(yīng)答、提高產(chǎn)奶量[2]。植物乳桿菌Lp299v（Lactobacillus plantarum 299v，DSM9843）是一種源自人類腸道的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有抗炎特性和保護(hù)腸道屏障作用。Johansson等研究表明，Lp299v在人類上消化道中具有較高存活率，可增加糞便中乙酸和丙酸濃度[3]。Klarin等研究指出Lp299v可降低梭菌感染患者腹瀉發(fā)生率[4]。Frida等研究表明，孕期和哺乳期大鼠飼喂Lp299v，對(duì)其后代腸道及相關(guān)器官生長(zhǎng)和功能具有促進(jìn)作用[5]。Michael等研究指出，Lp299v可增強(qiáng)機(jī)體鐵吸收能力，提高免疫力[6]。

目前Lp299v研究主要集中在人類和單胃動(dòng)物方面，奶牛領(lǐng)域研究較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)奶牛添加不同劑量Lp299v，旨在探討其對(duì)奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、泌乳性能、血液指標(biāo)和腸道微生物菌群影響，明確Lp299v飼喂奶牛效果，為L(zhǎng)p299v在反芻動(dòng)物領(lǐng)域應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物乳桿菌Lp299v培養(yǎng)

Lp299v（菌號(hào)：DSM9843）由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。首先在MRS肉湯培養(yǎng)基中于37℃，180 r·min-1活化24 h。將1 mL活化培養(yǎng)物再次接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。3 000 r·min-1離心20 min后，獲得沉淀物用生理鹽水沖洗2次，加入25 mL無(wú)菌蒸餾水，調(diào)節(jié)菌濃度為1×1010cfu·mL-1。使用MRS瓊脂培養(yǎng)基作平板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)Lp299v菌落數(shù)。所得懸浮液飼喂奶牛。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年6～8月于哈爾濱完達(dá)山奶牛養(yǎng)殖有限公司開(kāi)展。涉及動(dòng)物試驗(yàn)均按照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)（協(xié)議編號(hào)：NEAU-[2011]-9）規(guī)定執(zhí)行。試驗(yàn)采用3×3拉丁方設(shè)計(jì)，選取6頭健康荷斯坦奶牛：體重（625±12.3）kg；泌乳天數(shù)（52±3.8）d；產(chǎn)奶量（32.1±1.68）kg；胎次=2，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組（添加量為0.5×1011cfu·頭-1·d-1Lp299v）和高劑量組（添加量為1×1011cfu·頭-1·d-1Lp299v）。試驗(yàn)期28 d，21 d為適應(yīng)期，7 d采樣期。奶牛于每日6:00～6:30和18:00～18:30擠奶2次，并在擠奶后投放全混合日糧（日糧配方見(jiàn)表1）。試驗(yàn)期內(nèi)，奶牛單欄飼養(yǎng)（4 m×5 m），可自由采食（約5%剩料量）和飲水。

1.3 日糧和糞樣采集

于試驗(yàn)每期第22～28天稱量每日提供和剩余全混合日糧重量（kg），計(jì)算干物質(zhì)采食量（Dry matter intake，DMI）。于試驗(yàn)每期第26、27和28天每日6:30和18:30分別收集飼料和糞便樣品各500 g，將兩次采集糞便和飼料樣品單獨(dú)混合均勻，-20℃保存，用于測(cè)定全消化道表觀消化率。此外，取每期第28天收集糞便樣品5 g于10 mL凍存管，立即保存至液氮，分析細(xì)菌群落組成。

1.4 奶樣和血液采集

于試驗(yàn)每期第26、27和28天記錄奶牛每日泌乳量，分別收集兩次奶樣50 mL，按照產(chǎn)奶體積比例將收集奶樣混合均勻（50 mL）。添加少量重鉻酸鉀于混合后奶樣，4℃保存，用于乳成分分析。于試驗(yàn)每期第26、27和28天，每日晨飼前使用無(wú)菌真空采血針在空腹奶牛尾靜脈處收集血液樣品15 mL，置于3個(gè)5 mL肝素鈉管（哈爾濱雙環(huán)農(nóng)林生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。2 000 r·min-1離心20 min后，將獲得血漿樣品轉(zhuǎn)移到10個(gè)1.5 mL清潔離心管中，-20℃保存，用于分析血漿相關(guān)參數(shù)。

表1 全混合日糧原料和化學(xué)組成（%干物質(zhì)）Table 1 Ingredients and chemical composition of total mixed ration(%of dry matter)

1.5 全消化道消化率和乳成分分析

根據(jù)Lee和Hristov描述方法，利用日糧和糞便中不可消化中性洗滌纖維（NDF）含量作為內(nèi)源標(biāo)志物估計(jì)營(yíng)養(yǎng)成分全消化道消化率[8]。將保存的飼料和糞便樣品于65℃下干燥72 h，并通過(guò)1 mm篩網(wǎng)粉碎。樣品中粗蛋白（CP）和干物質(zhì)（DM）含量參照AOAC[9]方法測(cè)定。根據(jù)文獻(xiàn)[10]方法，使用全自動(dòng)纖維分析儀（安康科技公司，馬其頓市，紐約州，美國(guó)）分析熱穩(wěn)定α-淀粉酶處理后樣品中NDF和酸性洗滌纖維（ADF）含量。根據(jù)Huhtanen等描述方法[11]，將樣品在瘤胃原位培養(yǎng)288 h后測(cè)定NDF含量。

牛奶樣品送至黑龍江農(nóng)墾科學(xué)院，使用全自動(dòng)近紅外牛奶分析儀（MilkoScan,Foss Electric,Hiller?d,Denmark）測(cè)定CP、脂肪、乳糖和尿素氮（MUN）濃度以及體細(xì)胞數(shù)（SCC）。

1.6 血漿參數(shù)分析

血漿樣品送至北京華英生物研究所，采用全自動(dòng)生化分析儀（HT82-BTS-330，北京西華科技有限公司）測(cè)定血漿中甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、非酯化脂肪酸（NEFA）、尿素、葡萄糖和β-羥基丁酸（BHBA）濃度。

使用市售試劑盒（南京建城生物工程研究所）測(cè)定血漿過(guò)氧化氫酶（CAT，試劑盒號(hào)：A007-1-1，鉬酸銨法）、總超氧化物歧化酶（T-SOD，試劑盒號(hào)：A001-1-2，羥胺法）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px，試劑盒號(hào)：A005-1-2，比色法）的濃度、丙二醛（MDA，試劑盒號(hào)：A003-1-2，硫代巴比妥酸法）、總抗氧化能力（T-AOC，試劑盒號(hào)：A015-1-2，比色法）濃度。操作步驟均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

血漿可溶性CD3（sCD3），可溶性CD4（sCD4），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白M（IgM），硫代甲狀腺素（T3），甲狀腺素（T4）和催乳素（PRL）濃度使用ELISA試劑盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）測(cè)定。操作步驟均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 糞便細(xì)菌群落分析

1.7.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

參照omega M5635-02試劑盒說(shuō)明方法提取糞便樣品DNA，使用核酸純化儀純化。隨后用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增16S rRNA基因V3-V4區(qū)域，擴(kuò)增引物為：338 F（5'ACTCCTACGGGAGGCAGCA 3'） 和806 R（5'GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3'）；擴(kuò)增體系（25 μL）為：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）2 μL，F(xiàn)orwardprimer（10 μmol· L-1）1 μL，Reverseprimer（10 μmol· L-1）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL；擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性98℃2 min；變性98℃15 s，退火55℃30 s，延伸72℃30 s，25～30個(gè)循環(huán)，延伸72℃5 min（注：調(diào)整退火溫度以確定最佳溫度，根據(jù)樣品微調(diào)循環(huán)數(shù)，確保使用最少循環(huán)擴(kuò)增出合格目標(biāo)條帶）。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用AXYGEN公司凝膠回收試劑盒切膠回收目標(biāo)片段。隨后參照電泳初步定量結(jié)果，對(duì)PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量?jī)x器為Microplate reader。

1.7.2 測(cè)序文庫(kù)制備和Illumina Miseq測(cè)序

采用Illumina公司TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)。先質(zhì)檢和定量文庫(kù)，將合格上機(jī)測(cè)序文庫(kù)梯度稀釋后，經(jīng)NaOH變性為單鏈上機(jī)測(cè)序。MiSeq測(cè)序儀作2×300 bp雙端測(cè)序，相應(yīng)試劑為MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）。

1.7.3 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0）識(shí)別疑問(wèn)序列后，調(diào)用USEARCH（v5.2.236）檢查并剔除嵌合體序列。經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后，參照Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（Release128,http://www.arb-silva.de）劃分序列OTU單元?；贠TU分析結(jié)果獲得其在門(mén)和屬兩個(gè)水平上的物種分布柱狀圖。采用Alpha多樣性分析Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS軟件包（版本9.2，SAS Institute Inc.,Cary，NC）中Proc Mixed模型，用3×3拉丁方設(shè)計(jì)程序分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。模型為：Yijkm=μ+Ti+Pj+Ck+Sm+Eijkm，其中，Yijkm代表觀測(cè)值，μ代表總體平均值，Ti代表處理固定效應(yīng)，Pj代表周期固定效應(yīng)，Ck代表不同處理奶牛隨機(jī)效應(yīng)，Sm代表固定平方效應(yīng)，Eijkm代表殘差。

此外，使用SAS軟件包中正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鯨p299v添加劑量效應(yīng)。使用鄧肯多重校正檢驗(yàn)確定不同處理之間差異。其中，P＜0.05代表顯著差異，0.05＜P＜0.10表示有變化趨勢(shì)。

表2 Lp299v對(duì)奶牛采食和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率影響Table 2 Effects of Lp299v on intake and nutrient digestibility in cows

2 結(jié)果與分析

2.1 采食和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化

Lp299v對(duì)奶牛采食和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化結(jié)果見(jiàn)表2。隨Lp299v添加量增加，奶牛DM、CP、NDF和ADF采食量均呈線性（P＜0.05）升高。與對(duì)照組相比，Lp299v飼喂高劑量組奶牛DM、CP、NDF和ADF采食量均顯著（P＜0.05）升高；Lp299v飼喂低劑量組奶牛ADF采食量顯著（P＜0.05）增加，而DM、CP和NDF采食量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。高劑量組奶牛DM、CP和ADF采食量均顯著（P＜0.05）高于低劑量組，而兩組間NDF采食量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

隨Lp299v添加量升高，奶牛DM、CP和NDF全消化道消化率均呈線性（P＜0.05）升高。與對(duì)照組相比，高劑量組奶牛CP和NDF消化率顯著（P＜0.05）增加，DM和ADF消化率無(wú)顯著變化（P＞0.05）；低劑量組奶牛CP消化率顯著（P＜0.05）升高，而DM、NDF和ADF消化率無(wú)顯著不同（P＞0.05）。高劑量組奶牛CP消化率較低劑量組顯著（P＜0.05）增加，其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 泌乳性能

由表3可知，隨Lp299v添加量增加，奶牛乳蛋白和乳糖產(chǎn)量及濃度均呈線性（P＜0.05）升高，而乳中體細(xì)胞數(shù)呈線性（P＜0.05）下降。與對(duì)照組相比，Lp299v飼喂高劑量組和低劑量組奶牛ECM、乳蛋白、乳糖產(chǎn)量和乳蛋白濃度均顯著（P＜0.05）增加，體細(xì)胞數(shù)顯著（P＜0.05）降低，且高劑量組乳蛋白濃度較低劑量組顯著升高（P＜0.05）。ECM、乳糖產(chǎn)量、乳蛋白濃度和體細(xì)胞數(shù)在高劑量組和低劑量組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），且奶、4%FCM、乳脂產(chǎn)量、尿素氮、乳脂濃度和飼料轉(zhuǎn)化率在各處理組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 Lp299v對(duì)奶牛泌乳性能影響Table 3 Effect of Lp299v on lactation performance in cows

2.3 血漿生化指標(biāo)

由表4可知，與對(duì)照組相比，Lp299v飼喂高劑量組和低劑量組奶牛血漿葡萄糖濃度均顯著（P＜0.05）升高，且高劑量組較低劑量組顯著（P＜0.05）升高，因而呈線性增加，增加比率分別為8.0%和14.8%。各處理組間奶牛血漿甘油三酯、膽固醇、非酯化脂肪酸、尿素和β-羥基丁酸濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.4 血漿抗氧化指標(biāo)

由表5可知，隨Lp299v添加量增加，奶牛血漿GSH-Px濃度呈線性升高（P＜0.05），而MDA呈線性下降（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，Lp299v飼喂高劑量組奶牛血漿GSH-Px濃度顯著（P＜0.05）增加，MDA濃度顯著（P＜0.05）降低，而低劑量組血漿GSH-Px和MDA濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各處理組間血漿CAT和T-SOD無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 血漿免疫和激素指標(biāo)

由表6可知，隨Lp299v添加量增加，奶牛血漿IgA、IgG和sCD4濃度呈線性升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，Lp299v飼喂高劑量組奶牛血漿IgA、IgG和sCD4濃度顯著（P＜0.05）增加，而低劑量組無(wú)顯著變化（P＞0.05）。此外，各處理組間奶牛血漿IgM、sCD3、T3、T4和PRL濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 Lp299v對(duì)奶牛血漿生化指標(biāo)影響Table 4 Effect of Lp299v on biochemistry indicesin cows (mmol·L-1)

表5 Lp299v對(duì)奶牛血漿抗氧化指標(biāo)影響Table 5 Effect of Lp299v on antioxidant indices in cows

表6 Lp299v對(duì)奶牛血漿免疫和激素指標(biāo)影響Table 6 Effects of Lp299v on immune and hormonal indices in cows

2.6 糞便細(xì)菌群落組成

如圖1 A所示，在門(mén)水平上，隨Lp299v添加量增加，奶牛糞便細(xì)菌擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）相對(duì)豐度呈線性（P＜0.05）增加（對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=23.5%vs.27.3%vs.32.9%），且高劑量組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著（P＜0.05）升高。相反，飼喂Lp299v奶牛糞便細(xì)菌厚壁菌門(mén)（Firmicutes，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=69.0%vs.67.7%vs.61.4%）、放線菌門(mén)（Actinobacteria，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=24.1%vs.20.2%vs.12.9%）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=23.5%vs.9.17%vs.12.1%）相對(duì)豐度隨Lp299v添加呈線性下降（P＜0.05），且高劑量組和低劑量組疣微菌門(mén)相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著（P＜0.05）降低，高劑量組厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著（P＜0.05）降低。各處理組間其他細(xì)菌相對(duì)豐度在門(mén)水平上無(wú)顯著差異（P＞0.05）。如圖1 B所示，在屬水平上，隨Lp299v添加量增加，理研菌科RC9_gut_群（Rikenellaceae_RC9_gut_group，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=6.93%vs.12.5%vs.14.4%）和普雷沃氏菌科UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=0.84%vs.1.93%vs.4.11%）相對(duì)豐度呈線性增加（P＜0.05），且均較對(duì)照組（P＜0.05）顯著升高。相反，飼喂Lp299v奶牛糞便細(xì)菌羅姆布茨菌屬（Romboutsia，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=9.04%vs.6.76%vs.3.57%）和普雷沃菌屬_1（Prevotella_1，對(duì)照vs.低劑量組vs.高劑量組=6.94%vs.5.47vs.2.41%）呈線性降低，且高劑量組較對(duì)照組（P＜0.05）顯著降低。各處理組間其他細(xì)菌相對(duì)豐度在屬水平上無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.7 糞便細(xì)菌Alpha多樣性

Lp299v對(duì)奶牛糞便細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)影響見(jiàn)表7。隨Lp299v添加量增加，奶牛糞便細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)呈線性升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，Lp299v飼喂高劑量組奶牛糞便細(xì)菌Simpson指數(shù)顯著（P＜0.05）提高，而低劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。此外，各組間Shannon、Ace和Chao指數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表7 Lp299v對(duì)奶牛糞便細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)影響Table 7 Effect of Lp299v on fecal bacterial alpha diversity indices in cows

3 討論

3.1 Lp299v對(duì)奶牛采食和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化影響

促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)采食和消化對(duì)奶牛生產(chǎn)性能提高具有重要作用。艾日登才次克等研究發(fā)現(xiàn)飼喂復(fù)合乳酸菌奶牛采食量較對(duì)照組顯著升高[12]。Jaquette等研究表明添加嗜酸乳桿菌BT1386可顯著提高奶牛采食量[13]。但Raeth-Knight等研究指出奶牛飼喂嗜酸乳桿菌LA747后采食量無(wú)明顯變化[14]。結(jié)果可能與不同乳酸菌特性不同有關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加Lp299v可顯著提高奶牛DM、CP、NDF和ADF采食量，且隨Lp299v添加量增加呈線性升高。添加乳酸菌可提高奶牛采食量[12-13]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全消化道消化率情況未見(jiàn)報(bào)道。此外，Raeth-Knight等報(bào)道稱添加嗜酸乳桿菌對(duì)奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率無(wú)顯著影響[14]。相比而言，本研究飼喂Lp299v后奶牛CP和NDF全消化道表觀消化率顯著提高，且隨Lp299v添加量增加呈線性升高，推測(cè)與添加Lp299v后奶牛腸道細(xì)菌群落組成改變有關(guān)。Durso等研究指出擬桿菌門(mén)可提高日糧中蛋白質(zhì)、淀粉和纖維降解以及腸內(nèi)肽和氨基酸吸收，有助于提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化水平[15]。因此，飼喂Lp299v后奶牛糞便細(xì)菌擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度提高可能導(dǎo)致CP和NDF消化率增加。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Lp299v可作為益生菌促進(jìn)奶牛采食和消化，有助于提高奶牛泌乳性能。

3.2 Lp299v對(duì)奶牛泌乳性能影響

添加乳酸菌可提高奶牛乳脂率[2]，本研究發(fā)現(xiàn)Lp299v添加對(duì)奶牛乳脂率和乳脂產(chǎn)量無(wú)顯著影響，可能與乳酸菌功能特性不同有關(guān)。碳水化合物在奶牛瘤胃內(nèi)降解為乙酸、丙酸和丁酸。乙酸和丁酸含量增加可促進(jìn)血液中NEFA和BHBA升高，進(jìn)而促進(jìn)乳脂合成。丙酸可通過(guò)糖異生作用在血液中生成葡萄糖，促進(jìn)乳糖合成。本研究發(fā)現(xiàn)，奶牛飼喂Lp299v后血漿葡萄糖濃度顯著升高，NEFA和BHBA濃度無(wú)顯著變化，推測(cè)因日糧中添加Lp299v奶牛乳糖產(chǎn)量和乳糖率提高，乳脂率和乳脂產(chǎn)量無(wú)變化。Jaquette等報(bào)道也發(fā)現(xiàn)乳酸菌飼喂可促進(jìn)奶牛乳糖合成，但對(duì)乳脂合成無(wú)顯著影響[13]。奶牛飼喂Lp299v后ECM、乳蛋白產(chǎn)量和乳蛋白率顯著提高，且隨Lp299v添加量增加呈線性升高，與蔣小藝等報(bào)道結(jié)果一致[2]。劉彩娟等研究發(fā)現(xiàn)飼喂乳酸菌可促進(jìn)奶牛泌乳和乳蛋白合成[16]。Stein等研究指出血液葡萄糖升高可促進(jìn)乳糖合成，提高產(chǎn)奶量[17]。此外，飼喂Lp299v后奶牛日糧中DM和CP全消化道表觀消化率顯著提高，說(shuō)明奶牛消化吸收較多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)，可能是提高奶產(chǎn)量和乳蛋白合成原因。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率提高有助于提高奶牛泌乳性能[18]。此外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，添加Lp299v可顯著降低乳中體細(xì)胞數(shù)，且隨Lp299v添加量增加呈線性降低，可能為飼喂Lp299v后奶牛免疫能力提高所致。

3.3 Lp299v對(duì)奶牛血液代謝影響

血液葡萄糖對(duì)動(dòng)物維持正常體溫和生理活動(dòng)具有重要作用[19]。對(duì)泌乳奶牛而言，葡萄糖可為奶牛泌乳提供能量，促進(jìn)乳糖合成量和泌乳量[17]。本研究中，奶牛飼喂Lp299v后血漿葡萄糖濃度顯著升高，且隨Lp299v添加量增加呈線性升高。推測(cè)與添加Lp299v后奶牛采食量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率提高相關(guān)。Vol等報(bào)道稱，動(dòng)物消化吸收更多營(yíng)養(yǎng)物有利于向血液葡萄糖轉(zhuǎn)化[20]。關(guān)于乳酸菌引起奶牛血液葡萄糖濃度變化原因報(bào)道較少，Lp299v添加后奶牛血漿葡萄糖濃升高機(jī)理有待研究。

GSH-Px是一種過(guò)氧化物酶，在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，可將有毒過(guò)氧化物還原成無(wú)毒羥基化合物，提高機(jī)體抗氧化能力。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化重要產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生加重機(jī)體氧化損傷。本文飼喂Lp299v后奶牛血漿GSH-Px濃度顯著升高，MDA濃度顯著下降，且分別隨Lp299v添加量增加呈線性升高和降低，說(shuō)明Lp299v可提高奶?？寡趸芰ΑＭ茰y(cè)因Lp299v作為氫質(zhì)子或電子的供體，可終止自由基鏈鎖反應(yīng)并與金屬離子結(jié)合，發(fā)揮抗氧化作用。張志軍研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含復(fù)合乳酸菌可降低血漿中丙二醛含量，提高綿羊抗氧化能力，與本研究結(jié)果一致[21]。

乳酸菌在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面具有重要作用。乳酸菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后與腸道菌群及上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞相互作用，同時(shí)觸發(fā)和刺激免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體，提高機(jī)體免疫力[22]。目前研究仍未發(fā)現(xiàn)某特定乳酸菌可應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)，發(fā)揮免疫功能。一方面不同乳酸菌種發(fā)揮免疫功能效果不同；另一方面奶牛瘤胃微生物影響乳酸菌在腸道發(fā)揮作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Lp299v低劑量組奶牛血漿免疫指標(biāo)較對(duì)照組無(wú)顯著差異，但高劑量組奶牛血漿IgA、IgG和sCD4濃度升高?？赡芤騆p299v添加量升高可抑制腸道有害菌生長(zhǎng)，發(fā)揮免疫作用。

3.4 Lp299v對(duì)奶牛糞便細(xì)菌群落影響

腸道微生物群落組成結(jié)構(gòu)在改善動(dòng)物生理、健康和生產(chǎn)力方面具有重要作用。研究表明，乳酸菌可通過(guò)在動(dòng)物腸道內(nèi)定植調(diào)整腸道細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，糞便樣品中相對(duì)豐度最高為厚壁菌門(mén)，其次為擬桿菌門(mén)。與Daniela等報(bào)道一致，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為奶牛腸道中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[24]。關(guān)于不同處理組間結(jié)果，飼喂Lp229v奶牛糞便細(xì)菌擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著提高，且隨Lp229v添加量增加呈線性升高。普雷沃氏菌科UCG-003屬于擬桿菌門(mén)，隨Lp229v添加量增加呈線性升高。研究表明，擬桿菌門(mén)細(xì)菌成員主要功能為日糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度升高說(shuō)明Lp229v添加有助于奶牛消化吸收營(yíng)養(yǎng)物，提高泌乳性能。Rice等研究指出腸道細(xì)菌擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)[25]。與上述結(jié)果一致，奶牛糞便細(xì)菌厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度隨Lp229v添加量增加呈線性降低。此外，糞便細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)隨Lp229v添加量增加呈線性升高，說(shuō)明添加Lp229v可豐富奶牛腸道微生物多樣性，有助于促進(jìn)奶牛健康。奶牛腸道微生物群落組成復(fù)雜，Lp229v影響腸道細(xì)菌機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，添加Lp299v可提高奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、泌乳性能、抗氧化和免疫功能、調(diào)整腸道細(xì)菌群落組成。Lp299v飼喂奶牛推薦添加劑量為1×1011cfu·頭-1·d-1。