佘新松，翟大才，胡宗浩，滕蕓蕓，朱雯培，李士壯，柏曉輝

(黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041)

無刺枸骨（Ilex cornutavar.fortunei），是冬青屬（IlexL.）植物枸骨（Ilex cornutaLindl. et Paxt.）的自然變種，是一種常綠小喬木或灌木，其葉形奇特，球形核果入秋成熟轉(zhuǎn)紅，鮮艷奪目，是一種良好的觀賞樹種[1]。枸骨在我國長江下游各省均有分布，且其根、樹皮、葉與果實等均可入藥，具有益腎、活絡(luò)強筋等功效，可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)酸痛、腰肌勞損等病癥[2]。此外，有文獻報道，無刺枸骨具有降血脂、抗生育和抑菌等作用[3]，但具體作用機制不明。

目前，關(guān)于無刺枸骨的研究主要集中在無刺枸骨快速繁殖與扦插技術(shù)[4-5]、嫁接與造型技術(shù)[6]，無刺枸骨葉片結(jié)構(gòu)對環(huán)境溫度的適應(yīng)[7]、枸骨和無刺枸骨不同光強下光合能力比較[8]，無刺枸骨不同部位齊墩果酸和熊果酸的含量分析[1]及果實總黃酮的提取及穩(wěn)定性研究[3]等，對無刺枸骨果實化學(xué)成分的研究較少，而對其果實抗氧化和抑菌活性研究仍處于空白階段。本文以無刺枸骨果實為對象，采用多種極性不同的溶劑分別對其果實的活性物質(zhì)進行萃取，并采用2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、濾紙片抑菌法檢測其活性物質(zhì)的抗氧化活性與抑菌活性；同時結(jié)合GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）技術(shù)對抗氧化及抑菌活性顯著的正丁醇萃取物化學(xué)組成進行分析鑒定，以期為無刺枸骨果實資源的綜合利用與開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 儀器設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋（SQ510C型，重慶雅馬拓科技公司）、恒溫培養(yǎng)箱（ZGP-2 050型，上海智城分析儀器公司）、超凈工作臺（ZHJH-C1106B型，上海智城分析儀器公司）、紫外可見分光光度計（UV754N型，上海精密科學(xué)儀器公司）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7 890 A-5 975C型，美國Agilent公司）。

1.1.2 試劑 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購于東京化成株式會社，均為分析純；無水乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、過硫酸鉀等試劑購于上海國藥集團，均為分析純；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉和維生素C等生化試劑購于上海生工有限公司。

1.1.3 實驗材料 實驗所用的無刺枸骨成熟期果實（憑證標本采集號-03；采集人：佘新松；鑒定人：方建新；采集地點：安徽屯溪；采集時間：2019年12月4日）采集于黃山學(xué)院校園內(nèi)。

本文抑菌實驗所用菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris），以上菌株保存于黃山學(xué)院微生物學(xué)實驗中心且均購自于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。抑菌實驗所用固體培養(yǎng)基為LB（Luria-Bertani）平板培養(yǎng)基，其配制方法參考文獻[9]。

1.2 實驗方法

1.2.1 無刺枸骨果實成分的提取 將采集的新鮮無刺枸骨果實去果梗后粉碎至糊狀，稱取20.0 g糊狀果實于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL甲醇并于60 ℃恒溫萃取3 h；過濾后收集上清液，并向濾渣中再加入新甲醇200 mL后重復(fù)提取2次；將3次提取液合并后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)60 ℃真空蒸干得到甲醇粗提物，收集并稱質(zhì)量后用100 mL雙蒸水重懸甲醇粗提物，再按1:1等體積比依次加入100 mL正丁醇、乙酸乙酯和石油醚進行萃取，各萃取溶劑分別重復(fù)3次，收集300 mL各萃取相溶劑后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)60 ℃減壓旋干并稱質(zhì)量；最后用無水乙醇分別將上述萃取物配制成10 mg·mL-1溶液，保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 無刺枸骨果實萃取物對ABTS自由基的清除能力 參考文獻[10]方法檢測并改進無刺枸骨果實萃取物清除ABTS自由基的能力，方法如下：按體積比1∶1分別移取2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液與7 mmol·L-1ABTS溶液混勻并避光反應(yīng)12 h；用甲醇將反應(yīng)后ABTS液稀釋至λ734nm吸光值為0.68～0.72待用。分別移取無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物不同濃度溶液200 μL于2 mL上述甲醇稀釋后的ABTS溶液中，混勻后于暗處室溫反應(yīng)6 min測其吸光值A(chǔ)x。以相同方法測定200 μL甲醇與2 mL反應(yīng)后的ABTS溶液反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)0；同時，測定100 μL不同濃度的無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物溶液與2 mL甲醇反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)y，每組重復(fù)測定3次。以Vc為陽性對照，采用上述方法測定其清除ABTS自由基的能力，重復(fù)3次。按公式（1）計算清除ABTS自由基的清除率(Y)，取其平均值進行分析。

1.2.3 無刺枸骨果實萃取物對DPPH自由基的清除能力 參考文獻[11]方法并適當(dāng)改善檢測無刺枸骨果實萃取物清除DPPH自由基的能力，方法如下：分別移取經(jīng)無水乙醇稀釋的無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物溶液100 μL于0.06 mmol·L-1DPPH-乙醇（95%）溶液中配制成一系列不同濃度的溶液，混勻并避光反應(yīng)20 min后于λ517nm處測定吸光值Bx。同時，吸取100 μL無水乙醇至DPPH-乙醇（95%）溶液中作為對照組，測定其吸光值B0。以Vc為陽性對照，采用上述方法測定其清除DPPH自由基的能力，重復(fù)3次。按公式（2）計算清除DPPH自由基的清除率（Z），取平均值進行分析。

1.2.4 無刺枸骨果實萃取物的抑菌活性 參考文獻[9]方法檢測無刺枸骨果實萃取物對不同受試菌的抑菌活性，方法如下：將活化后的受試菌枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和變形桿菌培養(yǎng)至λ600nm處吸光值為0.25～0.35，吸取100 μL上述菌液于LB固體培養(yǎng)基上涂布均勻，放置直徑6 mm無菌濾紙片，分別吸取10 μL無刺枸骨果實甲醇粗提物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物滴加于紙片中央；以無水乙醇為空白對照，將以上LB固體培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)12 h，測量并記錄抑菌圈的大小，重復(fù)3次，以其均值進行分析。

1.2.5 無刺枸骨果實正丁醇萃取物GC-MS分析依據(jù)文獻[12-13]的方法并改進，采用HP-5 MS石英毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）為色譜柱對無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物進行GC-MS分析，萃取物進樣量為0.5 μL；以純度99.999 %氦氣作為載氣，流速設(shè)置為1.0 mL·min-1；柱箱采取程序梯度升溫：起始溫度設(shè)置為50℃，先以4℃·min-1速率升至150℃后保持1 min，再以1℃·min-1速率升至220℃后維持1 min，最后以3℃·min-1速率升至260℃后維持5 min，共運行50 min。

采用電子轟擊（EI）離子源，70 eV電子能量；設(shè)置離子源為230℃，四極桿為150℃；掃描質(zhì)量數(shù)范圍m/z為50.0～500.0，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫選擇為標準譜庫NIST08。

1.2.6 無刺枸骨果實正丁醇萃取物UPLC-Q-TOF/MS分析 參考文獻[14-16]中的方法并適當(dāng)修改測定正丁醇萃取物的成分，具體參數(shù)簡述如下：取1 μL待測樣品注入UPLC儀器中，設(shè)置流速為0.3 mL·min-1；采用ACQUITY HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，柱溫恒定為30℃；流動相分別為0.1%甲醇水溶液（A）和乙腈（B）；洗脫程序設(shè)置為：0～10 min，5% B；10～20 min，20% B；20～28 min，40% B；28～38 min，60%B；38～43 min，100% B；43～46 min，100% B；46～50 min，5% B。采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度設(shè)為100℃，脫溶劑氣（N2）溫度為400℃；毛細管電壓設(shè)為2.0 kV，錐孔電壓為40 V；錐孔氣（N2）流量設(shè)為50 L·h-1；利用氬氣作為碰撞氣，碰撞能量為6 V和20～30 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 無刺枸骨果實萃取物的抗氧化活性

2.1.1 無刺枸骨果實萃取物對ABTS自由基的清除作用 將無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物稀釋為一系列濃度梯度，檢測其對ABTS自由基的清除作用。圖1表明：無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯與石油醚萃取物對ABTS自由基的清除作用均與萃取物濃度呈正相關(guān)，即ABTS自由基清除率隨萃取物濃度增加而增大，當(dāng)正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物濃度分別為0.075、0.125、0.625 mg·mL-1時，對ABTS自由基清除率分別為99.68%、99.95%、53.21%。陽性對照Vc濃度（X）與ABTS自由基清除率（Y）的線性回歸方程為：Y=20 783.00X+5.94 (R2=0.971 1)。無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物及Vc對ABTS自由基清除作用的ED50值分別為0.033 6、0.054 0、0.559 1、0.002 1 mg·mL-1。

圖1 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇(A)、乙酸乙酯(B和石油醚(C)萃取物對ABTS自由基的清除作用。Fig. 1 Free radical scavenging assays of the 1-butanol (A), ethyl acetate (B), and petroleum ether (C) extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei against ABTS

2.1.2 無刺枸骨果實萃取物對DPPH自由基的清除作用 分別取無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等萃取物稀釋為一系列梯度，檢測其對DPPH自由基的清除作用。圖2可知：無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯與石油醚萃取物對DPPH自由基的清除作用均與萃取物濃度呈正相關(guān)，且隨著萃取物濃度增加，DPPH清除率顯著增大。當(dāng)正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物濃度分別為0.125、0.25、1.25 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率分別為90.83%、98.15%、75.50%。陽性對照Vc濃度（X）與DPPH自由基清除率（Y）的線性回歸方程為：Y=18 986.00X+4.49 (R2=0.987 3)。無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取物及Vc對ABTS自由基清除作用的ED50值分別為0.054 3、0.096 4、0.774 1、0.002 4 mg·mL-1。

圖2 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇(A)、乙酸乙酯(B和石油醚(C)萃取物對DPPH自由基的清除作用Fig. 2 Free radical scavenging assays of the 1-butanol (A), ethyl acetate (B), and petroleum ether (C) extraction from the crude methanol extract of of the fructus of I. cornuta var fortunei against DPPH

2.2 無刺枸骨果實萃取物的抑菌作用

以濾紙片抑菌法檢測無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌與變形桿菌的抑菌活性。圖3結(jié)果表明：正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對上述5種受試菌均有抑制作用。與對照乙醇相比，正丁醇萃取物的抑菌效果最顯著，對5種受試菌的抑制作用順序為：鼠傷寒沙門氏菌＞變形桿菌＞枯草芽孢桿菌＞綠膿桿菌＞金黃色葡萄球菌，抑菌圈減去同條件下乙醇對照的均值分別為6.20、5.15、4.24、3.45、3.24 mm；乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和變形桿菌有顯著抑制作用，對金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌無顯著抑制作用；石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌有顯著抑制作用，對綠膿桿菌和變形桿菌無顯著的抑制作用。

圖3 無刺枸骨果實萃取物對不同受試菌的抑菌作用Fig. 3 Antibacterial activity of the solvent extraction of the fructus of I. cornuta var fortunei against the different tested bacteria

圖4 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物GC-MS總離子流Fig. 4 The total ion chromatogram of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS

2.3 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物化學(xué)成分分析

2.3.1 無刺枸骨果實甲醇粗提物的正丁醇萃取物GC-MS分析 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物抗氧化活性和抑菌效果最好，故采用GCMS技術(shù)對其進行化學(xué)組成分析，總離子流結(jié)果見圖4。通過與標準譜庫NIST08的質(zhì)譜峰比對分析，結(jié)合峰面積歸一法分析其各組分的相對含量（表1）。由圖4和表1可知：無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物中共分離出色譜峰35個，經(jīng)鑒定后得到14個化合物（表1），占正丁醇萃取物總量的83.15%，其相對含量高于1.00%的化合物依次為N1-(叔丁基)-2-(2-[2-[(叔丁基氨基)碳硫基]肼基]亞乙基)肼-1-碳硫酰胺（48.63%）、丁醛二丁基乙縮醛（25.53%）、1-丁氧基-2-乙基-1-己烯（2.37%）、丁酸丁酯（1.67%）和丙位癸內(nèi)酯（1.04%），這5種組分占總化合物的79.24%。

表1 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的GC-MS鑒定結(jié)果Table 1 The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by GC-MS

2.3.2 無刺枸骨果實甲醇粗提物的正丁醇萃取物UPLC-Q-TOF/MS分析 利用UPLC-Q-TOF/MS同時對無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物化學(xué)組成進行定性分析，其總離子流結(jié)果見圖5，推測和鑒定出化合物共10種（表2）。從表2可知：鑒定出的10種化合物含有2種乙酰腈、2種酯類、3種羧酸、2種酮類和1種酰胺。

圖5 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物UPLCQ-TOF/MS總離子流Fig. 5 The total ion chromatogram of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by UPLC-Q-TOF/MS

3 討論

現(xiàn)有研究表明，枸骨具有降血脂、抗生育和抑菌等作用[3]，但具體藥用分子不明。為探究無刺枸骨成熟果實中的藥效分子，本文首次利用不同極性的有機溶劑正丁醇、乙酸乙酯和石油醚等溶劑對其生物活性成分進行萃取，并證明其萃取物具有非常好的抗氧化性；同時，發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性較好的成分主要富集在正丁醇相中。利用抑菌試驗，本文證明無刺枸骨果實成分具有較好的抑菌活性，這與現(xiàn)有的報道相吻合[3]。通過比較正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物的抑菌活性可發(fā)現(xiàn)，抑菌活性較好的生物活性成分也富集在正丁醇萃取物中，但具體的生物活性分子不明。

表2 無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物的UPLC-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果Table 2 The chemical constituents of the 1-butanol extraction from the crude methanol extract of the fructus of I. cornuta var fortunei by UPLC-Q-TOF/MS

采用GC-MS與UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對正丁醇萃取物進行分析，發(fā)現(xiàn)無刺枸骨果實中存在化合物(1S,3R,4R,5R)-3-((3-(3,4-二羥基苯基)丙烯酰)氧代)-1,4,5-三羥基環(huán)己羧酸，該化合物又稱為綠原酸[17]?，F(xiàn)有研究表明，綠原酸是很多藥材和中成藥具有消炎利膽、抗菌解毒的主要藥效分子[17]；其具有很強的清除DPPH自由基能力，也具有顯著的抗菌、抗病毒作用[17]。因此，正丁醇萃取物具有很強的抗氧化和抑菌活性可能與其含有綠原酸有關(guān)。同時，UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)顯示，無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇萃取物中的化合物比較多，值得進一步發(fā)掘。

4 結(jié)論

通過測定無刺枸骨果實甲醇粗提取物的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取物對ABTS和DPPH自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)萃取物均有較好的抗氧化性，其中，正丁醇萃取物的抗氧化能力最好。抑菌試驗表明，以上3種萃取物的抑菌能力為正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。通過GC-MS和UPLC-QTOF/MS技術(shù)對正丁醇萃取物成分的分析，本文首次報道綠原酸是無刺枸骨果實的重要藥效分子，這為無刺枸骨果實的綜合開發(fā)與利用提供了數(shù)據(jù)支持。