崔瑋,丁玲強,曾巧英

(1. 河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅張掖 734000; 2. 河西學(xué)院實驗動物中心,甘肅張掖 734000;3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 蘭州 730070)

甘青虎耳草(Saxifraga taugutica)是虎耳草科虎耳草屬植物。 為常用藏藥,藏藥名松滴,其味苦、性涼,清熱。 常用于治療急性中耳炎、風(fēng)熱咳嗽、大泡性鼓膜炎、風(fēng)疹瘙癢等[1]。 研究證實,甘青虎耳草中含有黃酮、多糖等生物活性物質(zhì),其中,乙酸乙酯提取物中槲皮素比較豐富[2],諸多研究表明,槲皮素通過調(diào)節(jié)抑癌基因表達、阻斷細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、干擾細胞信號傳導(dǎo)、抑制血管生成、阻滯腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移等多種機制來發(fā)揮抗腫瘤作用,對人前列腺癌、乳腺癌、肺癌、淋巴癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞均有抑制作用[3-6]。 肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,死亡率高[7],目前有關(guān)甘青虎耳草對肝癌是否有影響的研究報道較少,甘青虎耳草乙酸乙酯提取物(EtOAc extract from Saxifraga taugutica,EST)對肝癌H22 細胞和其肝原位移植瘤的抑制鮮有研究。 為此,本試驗研究了EST 對肝癌H22 細胞和其肝原位移植瘤生長的影響,旨在探討甘青虎耳草在肝細胞癌治療中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

小鼠H22 肝癌細胞,購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 實驗動物

6 周齡 SPF 級 KM 小鼠,體重 18 ～ 22 g,來源于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心【SCXK(甘)2015-0002】,在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗動物中心進行實驗【SYXK(甘)2015-0005】,所有操作均符合甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理學(xué)要求(審批號：2018-310)。

1.1.3 試劑

細胞DNA 提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司,批號：B511375);環(huán)磷酰胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號：H58849);丫啶橙(AO) (上海生工生物工程有限公司,批號：140810);噻唑藍(MTT)(上海源葉生物科技有限公司,批號：YY11351);多聚甲醛(Sigma 公司,批號：19J171120);蘇木精(天津光復(fù)化學(xué)試劑有限公司,批號：090408);伊紅(天津光復(fù)化學(xué)試劑有限公司,批號：75130319); RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibio 公司,批號：AE2446298);小牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司,批號：NYB0814)。

1.2 方法

1.2.1 EST 的制備

虎耳草→60℃ 烘干→粉碎→過篩(80 目)→石油醚浸泡(脫脂)→揮干→超聲輔助乙醇回流提取(100 W)→合并粗提液→室溫減壓抽濾→濾液減壓旋蒸→蒸餾水溶解→乙酸乙酯萃取→萃取液減壓濃縮→凍干→蒸餾水溶解→AB-8 大孔樹脂吸附→去離子水洗脫除雜→90% 乙醇洗脫→減壓濃縮→異丙醇洗滌(2 次)→過濾→濃縮→甲醇除雜→凍干(棕黃色粉末)→甘青虎耳草提取物。

以蘆丁作對照,硝酸鋁法測得甘青虎耳草提取物中黃酮的純度為82.07%。

1.2.2 EST 對H22 瘤細胞的體外抑制試驗

(1)H22 細胞的形態(tài)學(xué)觀察

將生長旺盛的H22 細胞以5 × 104細胞/孔接種于24 孔板,置37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,PBS 清洗一次,加入含EST 的培養(yǎng)液,使其終濃度分別為 0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL,培養(yǎng) 48 h 后1000 r/min,離心10 min,棄上清,PBS 洗兩次,收集細胞,加入100 μL PBS 重新懸浮細胞,與 4 μL AO/EB 熒光染液混合(AO、EB 各含 100 μg/mL),進行吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色。 30 s 后在激光共聚焦顯微鏡下觀察藥物作用于細胞后細胞的形態(tài)變化及細胞的凋亡情況[8]。

(2)H22 細胞的基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳分析

收集經(jīng) EST 0、20、40、100、200、500 μg/mL 處理的H22 細胞,用細胞DNA 提取試劑盒提取H22 細胞基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀拍照。 設(shè) PBS 對照。

(3)細胞凋亡率的檢測

收集經(jīng) EST 0 μg/mL 和 500 μg/mL 處理的兩組H22 細胞,根據(jù)凋亡試劑盒的說明書用流式細胞儀檢測分析。 每個處理 3 個重復(fù),設(shè) PBS 陰性對照。

1.2.3 EST 對H22 瘤細胞的體內(nèi)抑制試驗

(1)小鼠H22 肝癌細胞原位移植瘤模型的建立

依據(jù)參照文獻[9]的方法略作改進,取對數(shù)生長期的H22 細胞,用生理鹽水調(diào)整細胞密度(每毫升2× 106個),腹腔注射到雄性KM 小鼠體內(nèi),作為瘤源小鼠,取培養(yǎng)1 周的瘤源小鼠腹水,離心(1000 r/min、10 min)收集H22 細胞,生理鹽水調(diào)整細胞密度(2 × 107/mL) 制成細胞懸液;選取健康昆明種小鼠(雌雄各半)、麻醉、腹部手術(shù)、暴露肝,向肝內(nèi)注入10 μL H22 細胞懸液,棉簽壓迫止血、乙醇棉球擦拭,肝回納腹腔,縫合傷口,小鼠肝癌細胞原位移植瘤模型建立完畢。 另外,肝接種生理鹽水代替H22細胞實施假移植。

(2)動物的分組與處理

將肝癌原位移植瘤模型建立成功的小鼠隨機分為：低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組和環(huán)磷酰胺組,每組10 只,雌雄各半,假移植小鼠作為對照組(10 只,雌雄各半)。 手術(shù)24 h 后開始給藥,低、中、高劑量組分別灌胃 50、100、200 mg/kg 的EST 溶液,對照組、模型組灌胃生理鹽水,環(huán)磷酰胺組按20 mg/kg 腹腔注射環(huán)磷酰胺,各組均連續(xù)處理14 d。

(3)抑瘤率及臟器指數(shù)的測定

末次給藥12 h 后,脫頸處死小鼠,剖取肝、脾、胸腺,剝離肝腫瘤,計算抑瘤率和器官指數(shù)[10]。

抑瘤率(%)=[模型組平均瘤重(g)-給藥組平均瘤重(g)]/模型組平均瘤重(g)×100%

器官指數(shù)=器官重(mg)/體重(g)

(4)T 淋巴細胞增殖功能的測定

試驗動物的分組與處理同上,末次給藥12 h后,脫頸處死小鼠,無菌取脾,制備脾細胞懸液,用含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為每毫升2 × 106。 每份脾細胞懸液在24 孔培養(yǎng)板中加2 孔,每孔1 mL,其中一孔加50 μL ConA 液,另一孔不加ConA 液作對照,細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)44 h 時每孔棄去培養(yǎng)液0.7 mL,重新加入不含小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液0.7 mL,同時加入MTT(5 mg/mL),每孔50 μL,細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后每孔加入1 mL 酸性異丙醇,吹打多次,5 min 后用全波長酶標(biāo)儀測定570 nm 下的OD值,以加ConA 的吸光度值減去不加ConA 的吸光度值表示T 淋巴細胞增殖情況[11]。

(5)肝組織學(xué)檢測

用10%福爾馬林固定肝組織24 h,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色,光學(xué)顯微鏡400 倍視野下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 22.0 和 Excel 2016 進行統(tǒng)計學(xué)處理,用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)表示,組間均值比較采用單因素方差分析,以P＜0.05 為差異具有顯著性,P＜0.01 為差異極具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 EST 處理后H22 細胞的形態(tài)學(xué)觀察

如圖1 所示,經(jīng)AO/EB 細胞染色,陰性對照細胞形態(tài)規(guī)則均一,著色均勻,外形較圓,僅被AO 染色呈綠色;EST 處理細胞被 EB 染色,隨濃度增加呈黃綠色直至橙紅色,細胞膜皺縮、出芽、染色體固縮、邊聚、碎裂等細胞凋亡特征,數(shù)量和程度與濃度正相關(guān)。

2.2 H22 細胞的基因組 DNA 瓊脂糖凝膠電泳分析

如圖2 所示,H22 細胞在不同濃度的EST 處理48 h 后,其 DNA 圖譜在陰性對照(0 μg/mL)僅一條高分子質(zhì)量條帶;而其它濃度處理后均呈現(xiàn)典型的凋亡細胞特征性梯狀條帶,并隨著EST 濃度增加細胞凋亡特征性梯狀條帶越明顯,200 μg/mL 和500 μg/mL 處理組梯狀條帶最明顯。

2.3 細胞凋亡率的檢測

流式細胞儀分析表明,500 μg/mL EST 對H22細胞作用48 h,出現(xiàn)特征性的凋亡峰,即AP 峰,凋亡率為31%,而陰性對照(0 μg/mL)為 0.3%(圖3),兩組間差異極顯著(P＜0.01)。

注：a：正常細胞;b：細胞核碎裂;c：細胞核固縮;d：凋亡小體;e：壞死細胞。圖1 EST 作用48 h 對H22 肝癌細胞形態(tài)的影響Note. a, Normal cell. b, Nuclear fragmentation. c, Nuclear shrinkage. d, Apoptotic body. e, Necrotic cells.Figure 1 Effect of EST on the morphology of H22 hepatoma cells after 48 h treatment

圖2 EST 對H22 細胞作用的基因組DNA 片段電泳分析Figure 2 Electrophoretic analysis of genomic DNA fragments in H22 Cells by EST

圖3 EST 對H22 細胞作用的流式細胞分析圖Figure 3 Flow cytometric analysis of the effect of EST on H22 cells

2.4 EST 對小鼠H22 肝瘤的抑瘤效果

由圖4 可以看到,除對照組外,EST 各劑量組、模型組和環(huán)磷酰胺組小鼠的肝均有大小不同腫瘤,說明原位移植瘤模型的建立是成功的。

由表1 可知,給藥組平均瘤重顯著低于模型組(P＜0.05),且呈現(xiàn)出了一定的量效關(guān)系。 高劑量組的抑瘤率為64.3%,接近環(huán)磷酰胺組的78.7%。而根據(jù)國家藥監(jiān)局新藥特藥評審規(guī)定,抑瘤率達30%以上,就算作有效,即可作為新藥開發(fā)。 表明甘青虎耳草乙酸乙酯提取物在一定程度上能夠明顯抑制肝癌的生長。

2.5 EST 對小鼠免疫器官指數(shù)和T 淋巴細胞增殖能力影響

由表2 所示,與模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著下降(P＜0.05),其與環(huán)磷酰胺強大的免疫抑制作用有關(guān);與環(huán)磷酰胺組比較,EST 高劑量組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高(P＜0.05),提示該劑量甘青虎耳草乙酸乙酯提取物對小鼠免疫系統(tǒng)毒副作用較低。

由表2 也可看到,與空白對照組比較,模型組和環(huán)磷酰胺組小鼠 T 細胞增殖能力顯著下降(P ＜0.05);與模型組比較, EST 各劑量組小鼠T 細胞增殖能力顯著升高(P＜0.05),且具有劑量依賴趨勢,提示甘青虎耳草乙酸乙酯提取物能提升肝癌小鼠細胞免疫能力。

2.6 EST 對H22 肝癌小鼠肝組織形態(tài)的影響

圖4 小鼠肝癌細胞原位移植瘤生長情況Figure 4 Growth of orthotopic xenograft of mouse hepatoma cells

表1 EST 對小鼠H22 肝移植瘤的抑制作用( ˉx ±s,n=10)Table 1 Inhibition of EST on H22 liver xenograft in mice( ˉx ±s,n=10)

表2 EST 對小鼠器官指數(shù)和T 淋巴細胞增殖能力的影響( ˉx ±s,n=10)Table 2 Effects of EST on organ index and T lymphocyte proliferation in mice( ˉx ±s,n=10)

圖5 肝癌小鼠肝組織HE 染色結(jié)果(× 400,標(biāo)尺=20 μm)Figure 5 HE staining results of liver tissues of mice with liver cancer(× 400, Bar=20 μm)

如圖5 所示,對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,細胞排列整齊;模型組小鼠表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)紊亂、肝小葉消失、匯管區(qū)消失、細胞密度增加、細胞增生、細胞異型性明顯,表現(xiàn)出炎性反應(yīng)、癌變等特性;EST各治療組癌細胞有不同程度的生長抑制,主要表現(xiàn)為癌細胞固縮,癌細胞向周圍肝組織浸潤減少。

3 討論

肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一,具有治愈率低、致死率高等特點,對人類的生命健康構(gòu)成嚴重威脅。 當(dāng)前在對腫瘤患者實施臨床治療時,主要應(yīng)用順鉑、環(huán)磷酞胺等化療藥物,雖然有很明顯的抑制腫瘤作用,但是其毒副作用很大,表現(xiàn)為破壞機體免疫力、抗氧化能力和肝損傷等[12]。 近年來,研究發(fā)現(xiàn)很多傳統(tǒng)中藥在治療惡性腫瘤方面具有毒副作用小,可以提高腫瘤患者的生存質(zhì)量,在惡性腫瘤治療方面有廣闊的應(yīng)用前景[13]。 甘青虎耳草是有抗炎、抗氧化作用的常用藏藥。 近年研究發(fā)現(xiàn),同屬植物虎耳草具有抑制前列腺增生、提升Lewis 肺癌移植瘤小鼠抗氧化能力以及促進腫瘤細胞的凋亡,且顯示出有效、低毒的優(yōu)點[14]。 但甘青虎耳草及其活性成分在腫瘤治療方面的研究未見報道,因此,我們課題組設(shè)計試驗,用乙酸乙酯提取甘青虎耳草黃酮,研究其體外對小鼠H22 肝癌細胞的抑制作用以及體內(nèi)對小鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用。

結(jié)果顯示, EST 在體外能夠誘導(dǎo)H22 細胞的凋亡,且凋亡程度與EST 濃度相關(guān),濃度越大,H22 細胞凋亡程度越大。

體內(nèi)實驗表明,EST 各劑量組在小鼠體內(nèi)都能達到抑瘤的效果,其中高劑量(200 mg/kg)對小鼠H22 肝癌移植瘤的抑瘤率達到64.3%,具有顯著的生長抑制作用;腫瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果也顯示,EST 使肝癌細胞生長受到抑制,癌細胞向肝組織浸潤程度減輕,進一步表明EST 可以抑制肝癌生長。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能有關(guān),研究發(fā)現(xiàn),腫瘤患者免疫功能明顯低下,表現(xiàn)為胸腺嚴重萎縮,T、B 細胞增殖力下降,T 淋巴細胞總數(shù)、T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和 CD4+/CD8+比值均明顯低低下,提示癌癥患者機體免疫抑制是導(dǎo)致腫瘤無限制增長和免疫逃避的一個重要因素[15-16]。 本試驗體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,EST 能提升肝癌小鼠T 細胞增殖能力和胸腺指數(shù),對荷瘤小鼠免疫力低下有一定的改善作用,表明甘青虎耳草乙酸乙酯提取物可以有效增強肝癌小鼠的免疫功能,提高機體免疫力,從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述,甘青虎耳草乙酸乙酯提取物中主要的活性物質(zhì)—黃酮類物質(zhì),具有明顯的體內(nèi)外抗肝腫瘤活性,其作用機制可能與其增強機體免疫力促進肝癌細胞凋亡有關(guān)。 但甘青虎耳草乙酸乙酯提取物是如何激活機體免疫調(diào)節(jié)還有待進一步研究。