范一文 向慧敏 謝田甜

摘要以自然篩選的小諾霉素產(chǎn)生菌XDBJ-CF為誘變選育的出發(fā)菌株，經(jīng)最適照射劑量60 s的紫外誘變后，在含20 μg/mL鏈霉素的高氏平板上培養(yǎng)，獲得鏈霉素抗性突變株。突變株搖瓶初篩試驗(yàn)顯示，高產(chǎn)突變株的數(shù)量大于低產(chǎn)突變株。從正突變株中挑選相對發(fā)酵單位130%以上的16株高產(chǎn)突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，獲得2株小諾霉素高產(chǎn)突變株XDBJ-CF-09-24、XDBJ-CF-09-90，其小諾霉素產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高37.8%和46.3%，C?2b組分分別較出發(fā)菌株提高10%和20%。

關(guān)鍵詞小諾霉素產(chǎn)生菌;菌株選育;紫外誘變;鏈霉素抗性篩選

中圖分類號Q93文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2020）15-0109-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Breeding the Highyield Strain of Micronomicin by UV Irradiation Mutagenesis and Streptomycinresistant Screening

FAN Yiwen， XIANG Huimin， XIE Tiantian

（College of Biological Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）

AbstractThe original strain XDBJCF of micronomicin is obtained from the environment. It was irradiated by UV light for 60 s， then cultured in the plates with streptomycin of 20 μg/mL. The mutants with streptomycinresistant was obtained and fermented in the flasks. The result showed that among all flasks， the amount of the mutants with high yield of micronomicin was higher than those with low yield of micronomicin. We selected the 16 mutants with fermentation unit higher than 130% to ferment. Two mutants with the high yield of micronomicin were obtained：XDBJCF0924 and XDBJCF0990. The micronomicin yields generated from two mutants， XDBJCF0924 and XDBJCF0990 were 37.8% and 46.3% higher， respectively， and the component C?2bcontent of the production was 10% and 20% higher than those from the original strain.

Key wordsMicronomicinproducing bacteria;Strain breeding;Ultraviolet radiation;Streptomycinresistant screening

基金項(xiàng)目華南理工大學(xué)2018年校級學(xué)生研究計(jì)劃項(xiàng)目（B3180570）。

作者簡介范一文（1968—），女，安徽蕪湖人，高級實(shí)驗(yàn)師，從事生物制藥及其藥物分析實(shí)驗(yàn)室工作。

收稿日期2020-01-09

小諾霉素（micronomicin，MCR）是慶大霉素（GM）的C?2b組分，抗菌譜較廣，耳腎毒性低，且對6-N-乙?；傅哪退幘杂谢钚?，是一種替代GM的新型氨基糖苷類抗生素。生產(chǎn)小諾霉素的小單孢菌生長緩慢，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特殊，對物理、化學(xué)誘變劑耐受性強(qiáng)，誘變劑難以滲透到遺傳物質(zhì)上，故小諾霉素是國內(nèi)所有抗生素發(fā)酵單位較低的一個(gè)品種。長期以來，小諾霉素發(fā)酵單位的提高工作一直在尋求突破，但傳統(tǒng)的隨機(jī)篩選方法存在工作量大、隨機(jī)性大、周期長等缺點(diǎn)[1-3]。開展小諾霉素生產(chǎn)菌的高產(chǎn)誘變育種研究對于傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)業(yè)具有實(shí)際意義。

在抗生素高產(chǎn)菌株選育中，傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法因其簡單、快速、有效等優(yōu)點(diǎn)至今仍被廣泛使用。但是這些方法存在作用目標(biāo)不明確，有效突變率低、工作量大、篩選周期長等缺點(diǎn)，直接影響了誘變育種的工作效率。

應(yīng)用分子育種中關(guān)于抗生素產(chǎn)生菌抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因緊密連鎖而易發(fā)生共突變理論，抗性篩選方法可提高抗生素生產(chǎn)菌的突變率，加快菌株的選育進(jìn)程，有效提高抗生素產(chǎn)量[4-5]。此方法具有操作簡單、周期短、安全性好等特點(diǎn)，成為目前菌種選育領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[6-7]。其中以鏈霉素作為抗性篩選壓力，在包括小諾霉素在內(nèi)的多種抗生素產(chǎn)生菌選育所得到的突變株中都有較高的高效價(jià)突變株出現(xiàn)的頻率[8]。

將傳統(tǒng)的物理、化學(xué)誘變方法與抗生素抗性篩選相結(jié)合，有利于增加誘變育種的方向性、提高菌株的正突變率、加快菌株選育的進(jìn)程[9]。

該研究采用紫外誘變結(jié)合鏈霉素抗性篩選誘變處理方法選育小諾霉素高產(chǎn)菌株，在紫外誘變加大出發(fā)菌株正突變率的同時(shí)，使用鏈霉素抗性篩選，進(jìn)一步改良菌株，以期快速、有效地提高菌株的生產(chǎn)能力。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。

小諾霉素生產(chǎn)菌為絳紅色小單孢菌（XDBJ-CF），實(shí)驗(yàn)室保存。活性檢測菌為短小芽孢桿菌，從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購買。

1.1.2培養(yǎng)基。

斜面（分離）培養(yǎng)基（高氏I號合成培養(yǎng)基）從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購買。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉、葡萄糖、黃豆餅粉、玉米粉、魚粉等。

活性檢測培養(yǎng)基、抗生素檢定一號培養(yǎng)基，從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購買。

1.1.3試劑 ?。

硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate），大連醫(yī)藥集團(tuán)大連制藥廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1單孢子懸液的制備。

取培養(yǎng)9 d 的絳紅色小單孢菌（XDBJ-CF）新鮮斜面，用 10 mL生理鹽水洗下孢子，將孢子懸液轉(zhuǎn)入另一只帶有玻璃珠的三角瓶中，200 r/min ?37 ℃振蕩20 min，無菌脫脂棉過濾，制成107個(gè)/mL單孢子懸液。

1.2.2自然選育。

利用菌種的自發(fā)突變，將絳紅色小單孢菌（XDBJ-CF）的單孢子懸浮液涂布于高氏I號培養(yǎng)基平板上，置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)9 d，待長出單菌落后，隨機(jī)挑取單菌落于斜面保存，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，牛津杯法測抑菌圈直徑進(jìn)行篩選，從中選育抗生素相對高產(chǎn)的小單孢菌菌株作為誘變的出發(fā)菌株。

1.2.3鏈霉素最低抑菌濃度的測定。

取0.1 mL單孢子懸液均勻涂布在含鏈霉素濃度分別為5、10、12、14、16、18、20、22 μg/mL的高氏平板上，37 ℃培養(yǎng)9 d，記錄不同濃度平板上生長的菌落數(shù)。凡是在前一個(gè)低濃度平板上能長出菌落但在后一個(gè)較高濃度平板上未長出菌落的，后一濃度即為鏈霉素對小單孢菌的最低抑菌濃度。

1.2.4紫外誘變處理。

在黑暗條件下，打開紫外燈預(yù)熱20 min，然后將1 mL濃度為107個(gè)/mL的單孢子懸液在攪拌條件下于紫外誘變箱中（紫外燈功率為15 W，照射距離30 cm）分別照射0、15、30、45、60、75、90 s，誘變后的孢子懸浮液作適當(dāng)稀釋后分別涂布在含有最低抑菌濃度鏈霉素的高氏平板上，以未經(jīng)紫外照射的孢子懸液作為對照組。37 ℃避光培養(yǎng)9 d，分別統(tǒng)計(jì)各平板的菌落數(shù)，計(jì)算致死率，以確定最適紫外照射劑量。

1.2.5搖瓶篩選。

1.2.5.1搖瓶初篩。

將紫外照射后在含最低抑菌濃度的鏈霉素高氏平板上長出的突變株分別挑接在斜面上，37 ℃培養(yǎng)9 d。然后用接種環(huán)刮取1環(huán)孢子接種于裝有50 mL種子液的250 mL搖瓶中，在轉(zhuǎn)速240 r/min、溫度37 ℃搖床上種子培養(yǎng)84 h;再取12 mL種子培養(yǎng)液接種于裝有100 mL發(fā)酵液的500 mL搖瓶中，于34 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)144 h;發(fā)酵液用6.0 mol/L H?2SO?4酸化到pH 1～2，離心后取上清液，用磷酸緩沖液稀釋后，以二劑量法檢測發(fā)酵液效價(jià)和組分比。

1.2.5.2搖瓶復(fù)篩。

取初篩入選菌株再進(jìn)行二級搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵條件同上。

1.2.6牛津杯法。

吸取0.6 mL菌濃度為107個(gè)/mL的短小芽孢桿菌菌懸液至平板上，用涂布器涂布均勻后靜置，使其自然吹干;用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中;吸取一定體積的無菌過濾后的發(fā)酵液至牛津杯中;小心將培養(yǎng)皿移至培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)16 h;觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑。

1.2.7小諾霉素生物檢測法。二劑量法[10]。

1.2.8小諾霉素組分比檢測。采用硅膠薄層層析法檢測，V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（氨）= 2∶1∶1展層，碘顯色。

2結(jié)果與分析

2.1鏈霉素抗性突變株的制備

2.1.1自然選育結(jié)果。

從涂布有小單孢菌XDBJ-CF單孢子懸浮液的高氏平板（37 ℃培養(yǎng)9 d）上隨機(jī)挑48株（分別編號XDBJ-CF-X）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其發(fā)酵液的抗菌活性測定結(jié)果如圖1所示。在所選的48株菌種中，圖1中15號菌株所對應(yīng)的小單孢菌XDBJ-CF-09的抗生素發(fā)酵產(chǎn)率最高，利用牛津杯法測得其抑菌圈直徑達(dá)23.3 mm。試驗(yàn)將該菌作為紫外誘變的出發(fā)菌株。

2.1.2鏈霉素最低抑菌濃度的測定。

鏈霉素對XDBJ-CF-09菌株孢子最低抑菌濃度測定結(jié)果如下：5 μg/mL時(shí)菌株生長良好，10 μg/mL時(shí)菌株長勢一般，12 μg/mL時(shí)菌株長勢一般，14 μg/mL時(shí)菌株長勢一般，16 μg/mL時(shí)菌株長勢微弱，18 μg/mL時(shí)菌株長勢微弱，20 μg/mL時(shí)菌株不生長，22 μg/mL時(shí)菌株不生長。

當(dāng)鏈霉素濃度低于14 μg/mL時(shí)，菌株長勢基本正常;隨著鏈霉素濃度的增加，菌株生長受到抑制，在篩選平板上的單菌落明顯減少;當(dāng)鏈霉素濃度達(dá)20 μg/mL時(shí)，篩選平板上無單菌落形成，故鏈霉素對XDBJ-CF-09菌株的最小抑制濃為20 μg/mL，以此作為抗性篩選的條件。

2.1.3紫外誘變最適照射劑量選擇結(jié)果。

XDBJ-CF-09菌株的單孢子懸液經(jīng)過不同時(shí)間的紫外照射后進(jìn)行適當(dāng)稀釋，涂布于含20 μg/mL鏈霉素高氏平板上，用黑紙包裹住，防止光復(fù)活作用。隨著照射劑量加大，致死率逐漸遞增，當(dāng)照射時(shí)間為60 s時(shí)，致死率達(dá)82.16%，當(dāng)照射時(shí)間為90 s時(shí)，致死率達(dá)100%。該研究確定致死率82.16%的照射時(shí)間為最適紫外照射劑量（圖2）。

2.1.4獲取鏈霉素抗性突變株。

經(jīng)60 s紫外照射的單孢子懸液涂布在含最低抑菌濃度的鏈霉素高氏平板上，37 ℃避光培養(yǎng)9 d，長出的突變株為鏈霉素抗性突變株，共計(jì)201株。

2.2鏈霉素抗性高產(chǎn)突變株的篩選

將201株抗性突變株分別接入高氏斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)9 d，通過搖瓶初篩，經(jīng)生物檢測法檢測發(fā)酵單位，以誘變出發(fā)菌株的發(fā)酵單位設(shè)定為100%，換算突變株的相對發(fā)酵單位，篩選和檢測試驗(yàn)結(jié)果如表1。

根據(jù)表1的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，分別以相對發(fā)酵單位90%～110%為發(fā)酵單位未突變型，相對單位在90%以下為發(fā)酵單位負(fù)突變型和相對單位在110%以上為正突變型，3種類型分布頻率分別為33.83%、31.34%和34.83%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，小諾霉素發(fā)酵單位正突變型大于負(fù)突變型，其中發(fā)酵單位比誘變出發(fā)菌株提高30%以上的達(dá)到總菌株數(shù)的7.96%。

2.3突變株高產(chǎn)菌株小諾霉素組分比測定

根據(jù)搖瓶初篩結(jié)果，選取比誘變出發(fā)菌株發(fā)酵單位提高30%以上的高產(chǎn)突變株16株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，測定小諾霉素組分比，其測定結(jié)果見表2。

由表2可知，小諾霉素組分比C?2b∶C?1a較對照（CK）菌株XDBJ-CF-09提高的有2株：XDBJ-CF-09-24和XDBJ-CF-09-90，這2個(gè)菌株的C?2b∶C?1a的組分比分別達(dá)到7∶3和6∶4，C?2b較出發(fā)菌株提高10%和20%。2個(gè)菌株小諾霉素產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高37.8%和46.3%。

3結(jié)論

該試驗(yàn)在紫外誘變的基礎(chǔ)上，利用抗生素抗性篩選技術(shù)獲得鏈霉素抗性基因突變株201株，通過發(fā)酵篩選獲得2株發(fā)酵單位較出發(fā)菌株提高30%以上，組分比中C?2b組分較出發(fā)菌株提高10%以上的小單孢菌高產(chǎn)突變株。試驗(yàn)結(jié)果顯示了與相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]采用鏈霉素抗性篩選法取得正突變概率高于負(fù)突變的一致結(jié)果，表明鏈霉素抗性篩選方法在小諾霉素素高產(chǎn)菌株選育中具有應(yīng)用價(jià)值。

該試驗(yàn)僅對XDBJ-CF-09菌株抗性突變株的高產(chǎn)菌株進(jìn)行了搖瓶篩選，上罐發(fā)酵試驗(yàn)還在進(jìn)行之中。

參考文獻(xiàn)

[1] 王錦，段學(xué)輝，黎俊，等.利用抗自身代謝物特性進(jìn)行小諾霉素高產(chǎn)菌種選育[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（工科版），2006，28（2）：111-114.

[2] 管光瑜，廖崇娟，焦軍，等.慶大霉素產(chǎn)生菌棘孢小單孢菌孢子發(fā)芽的研究[J].抗生素，1981，6（1）：14-16.

[3] 劉均忠，李方林，張劍飛.小諾霉素生產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵工藝改進(jìn)的研究[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，2001，20（4）：5-7.

[4] 涂國全，鐘承贊，黃林，等.通過獲得鏈霉素抗性基因突變株篩選小諾霉素高產(chǎn)菌株[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（4）：19-22.

[5] 劉體顏，邢玉華，戴素琴，等.達(dá)托霉素生產(chǎn)菌（ATCC31568）的紫外誘變和抗生素抗性篩選[J].中國抗生素雜志，2013，38（9）：664-669.

[6] 戴菲，李瑾，黃運(yùn)紅，等.抗性篩選在抗生素高產(chǎn)菌選育中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（12）：7248-7249，7377.

[7] 孫玉雯，崔承彬.抗生素抗性篩選在微生物菌株選育中的作用[J].國際藥學(xué)研究雜志，2008，35（3）：213-217.

[8] 陶純長，諶頡，郭美錦，等.鏈霉素抗性突變理性篩選avermectin 高產(chǎn)菌株[J].中國抗生素雜志，2002，27（9）：521-523，528.

[9] 王慧媛，王澤建，黃明志，等.CO?2對脫氮假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B?12的影響[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，36（4）：499-505.

[10] 王瑤函，胡永紅，楊文革，等.N+低能離子注入與亞硝酸鈉復(fù)合誘變篩選子囊霉素高產(chǎn)菌株的研究[J].中國釀造，2012，31（4）：137-140.

[11] HOSOYA Y，OKAMOTO S，MURAMATAU H，et al.Acquisition of certain streptomycinresistant（str）mutations enhances antibiotic production in bacteria[J].Antimicrob agents chemother，1998，42（8）：2041-2047.

[12] 陳宏，張祝蘭，孫菲，等.鏈霉素抗性突變理性篩選新霉素高產(chǎn)菌株[J].生物技術(shù)通報(bào)，2014，31（12）：173-176.