摘要采用LPS誘導子宮內膜上皮細胞炎癥模型，通過研究細胞因子IL-1β、TNF-α mRNA的表達驗證模型，為進一步對子宮內膜炎發(fā)病機理的研究和治療藥物療效的評價奠定基礎。經組織塊原代培養(yǎng)和胰酶純化分離得到奶牛子宮內膜上皮細胞，并通過免疫組化鑒定細胞純度。采用0、10、30、50、100 μg/mL 的LPS分別在3、6、9、12、18 h刺激純化后的子宮內膜上皮細胞，采用MTT法篩選出最佳刺激濃度時間為30 μg/mL，12 h，然后以最佳刺激濃度刺激子宮內膜上皮細胞，在12 h后收集細胞，最后通過熒光定量RT-PCR檢測IL-1β、TNF-α mRNA的表達差異性。

關鍵詞奶牛子宮內膜炎;子宮內膜上皮細胞;細胞因子

中圖分類號S858.23文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2020）15-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of Inflammatory Injury Model of Endometrial Epithelial Cells Induced by LPS in Cows

CHEN Jiajia

（Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442）

Abstract The model of endometrial epithelial cell inflammation induced by LPS was used to study the expression of IL1β，TNFα mRNA，and lay the foundation for further pathogenesis of meningitis in utero treatment of research and evaluation of drug efficacy.Bovine endometrial epithelial cells （BEEC） were obtained and purified from cow uterus with primary cultured tissue explant and trypsin，and identified by immunohist chemistry.We used 0，10，30，50，100 μg/mL concentrations of LPS，respectively，after 3，6，9，12 h to stimulate purified endometrial epithelial cells，the results showed that the best situmulation concentration and time screened out by MTT method were 30 μg/mL（LPS） and 12 h respectively.BEEC were stimulated with 30 μg/mL LPS 12 h，and the cells were collected and ?fluorescence quantitative RT-PCR was made in order to detect the mRNA expression differences of IL1β，TNFα.

Key wordsCow endometritis;Endometrial epithelial cells（BEEC）;Cytokines

作者簡介陳佳佳（1989—），女，河南洛陽人，實驗師，碩士，從事畜牧獸醫(yī)和實驗技術研究。

收稿日期2019-12-03;修回日期2019-12-20

子宮是胚胎附植和孕育胎兒的場所。子宮壁由內膜、肌層和漿膜層構成。子宮內膜是激素作用的靶組織，在生殖生理研究中占據重要地位。哺乳動物的子宮內膜由上皮和固有層構成。正常情況下，子宮內膜上皮細胞和基質細胞受卵巢激素的調節(jié)發(fā)生周期性變化。奶牛分娩會對奶牛子宮內膜上皮細胞產生機械性損傷[1]，然而子宮復舊尚未完全，病原菌的污染會導致奶牛子宮內膜炎。病原微生物可引起子宮內膜上皮細胞發(fā)生一系列的病理解剖學變化，包括核染色質凝聚趨邊、核膜斷裂、內質網腫脹、線粒體腫脹變形[2]。在急性卡他性和化膿性子宮內膜炎中，患牛子宮內膜上皮細胞呈現不同程度的變性、壞死[3]。王洪海等[4]報道，對產后6～10 d的健康牛和急性子宮內膜患牛子宮內膜超微結構觀察發(fā)現子宮內膜炎患牛相當對照組子宮內膜局部嚴重脫落，上皮細胞和基質細胞大量破損[4]。

在奶牛子宮內膜炎致病菌中，大腸桿菌等革蘭氏陰性菌占有很大比例。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，由類脂A、非特異性核心多糖和O抗原3部分組成，其中類脂A是“毒力中心”[5]。當細菌死亡溶解或人工破壞菌細胞后釋放，又稱內毒素。脂多糖作為介導革蘭陰性菌膿毒癥的重要啟動因子，通過與其受體及其調節(jié)蛋白的結合，從而誘導機體多種細胞因子、炎性介質的合成和釋放，觸發(fā)機體一系列病理生理過程[6]。筆者采用MTT法檢測LPS對奶牛子宮內膜上皮細（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）細胞的增殖變化，建立奶牛子宮內膜上皮細胞炎性損傷模型，并通過檢測IL-1β、TNF-α mRNA表達水平驗證模型，旨在為進一步探討LPS誘導BEEC細胞炎性損傷機制提供研究基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1細胞來源。奶牛子宮內膜上皮細胞，原代組織培養(yǎng)第3～4代。

1.1.2儀器。

倒置生物顯微鏡（日本OLYMPUS，IX71/IX2）;二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-18AIC）;酶標儀（美國BIORAD，680 型）;核酸濃度測定儀（德國Eppendorf公司）;熒光定量PCR儀（美國STRATAGENE，MX3005P）。

1.1.3試劑。 胎牛血清（美國GIBCO，批號8199549）;DMEM/F12+GlutaMAX培養(yǎng)基（美國GIBCO，批號1354752）;O55∶B5脂多糖（Sigma 公司，L2880）牛角蛋白免疫組化試劑盒（上海研卉生物公司）;DAB Kit（北京中杉金橋生物公司）;M- mLV反轉錄酶、Taq?DNA聚合酶、RNA 酶抑制劑、dNTP（Promega 公司）。

1.2試驗方法

1.2.1奶牛子宮內膜上皮細胞的原代培養(yǎng)及分離純化。

1.2.1.1試驗動物取樣。

從屠宰場選取臨床正常，產后復舊完全的荷斯坦奶牛的子宮，30 min內結扎分離2個子宮角。用無菌生理鹽水（添加400 IU/mL青霉素，鏈霉素）保存，置于冰盒，1 h內送入實驗室。

1.2.1.2奶牛子宮內膜細胞的原代培養(yǎng)：組織塊培養(yǎng)法。

在超凈工作臺上，用剪刀剪開子宮角中段的側壁，暴露子宮腔;隨后將子宮內膜小心從子宮肌層上剝離下來，注意將肌層組織剝離干凈，并放入平皿中。用添加雙抗的PBS反復沖洗組織塊，直至沖洗液變清亮為止。用彎頭手術剪反復剪切子宮內膜至1 mm 3小塊為止，離心棄去上清，加入新的培養(yǎng)液，吸取若干組織塊，放入培養(yǎng)瓶中;小塊相互距離以0.5 cm為宜。翻轉培養(yǎng)瓶，置于CO?2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 h后;向培養(yǎng)瓶中注入少量細胞培養(yǎng)液（DMEM/F12GlutaMAX+10%FBS+雙抗），慢慢將培養(yǎng)瓶翻轉，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后補加少量細胞培養(yǎng)液。每天顯微鏡下觀察細胞游出情況，每隔1天換液1次。

1.2.1.3細胞計數及活力測定。

胰酶消化貼壁細胞，制備單細胞懸液，取0.1 mL 10倍稀釋。將稀釋后的細胞懸液與0.3%臺盼藍溶液以9∶1混合均勻，滴在細胞計數板上，在3 min內，低倍鏡下用細胞計數器分別記錄活細胞（無色透明）和死細胞（藍色）數量，按照以下公式計算細胞濃度和細胞活力：

細胞濃度=（4個大方格內活細胞總數/4）×104×稀釋倍數（1）

活細胞率=活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%（2）

1.2.1.4奶牛子宮內膜上皮細胞的分離純化。

當組織培養(yǎng)8～9 d后，子宮內膜細胞呈單層鋪開，用槍頭小心地將組織塊吹下并從培養(yǎng)瓶里棄去，用無Ca2+、Mg2+的PBS洗滌細胞2次，向25 mL細胞瓶里加入37 ℃預熱的0.25%的胰蛋白酶溶液0.5 mL，水平晃動細胞培養(yǎng)瓶消化3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察到大多數基質細胞變圓脫壁時，用PBS漂洗以除去基質細胞，隨后加入1 mL的0.25%的胰酶-EDTA消化2～3 min，用細胞培養(yǎng)液終止反應，輕輕吹打細胞瓶內壁，15 mL離心管收集細胞懸液，1 000 r/min下離心5 min，棄上清，加入細胞培養(yǎng)液，細胞計數和細胞活力計算后，按細胞濃度105個/mL接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO?2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2奶牛子宮內膜上皮細胞的鑒定。

角蛋白是上皮細胞膜上的特異性蛋白，通過免疫組化法來檢測細胞膜上角蛋白的表達，從而判斷細胞純化程度。經分離純化后，得到純度較高的上皮細胞，當融合率達到90%以上，用0.25%的胰酶-EDTA消化，傳代在6孔板中，孔板中放置高壓處理好的蓋玻片進行細胞爬片培養(yǎng)。細胞生長匯合后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次。4%的多聚甲醛固定15～30 min;空氣干燥5 min，用眼科鑷小心取出蓋玻片，注意玻片正反面。PBS洗滌2次。0.5%Triton X-100（DPBS配）孵育1次20 ?min。PBS清洗標本3次各2 ?min。加入3%H?2O?2浸泡10 min，除去內源性的過氧化氫酶，PBS沖洗3次;加入3% H?2O?2浸泡10 min，除去內源性的過氧化氫酶，PBS沖洗3次;將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐中蒸煮3 min，進行抗原修復，PBS沖洗3次;加入1滴山羊血清進行抗原修復，37 ℃孵育15 min;加入1滴1∶100倍稀釋的一抗，37 ℃孵育45 min，PBS沖洗5次;加入1滴生物素標記的羊抗兔IgG（二抗），37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5次;DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）;蘇木精復染10 min，沖洗;封片，拍照。

1.2.3 MTT篩選LPS作用濃度時間。

胰酶-EDTA消化并收集BEEC，臺盼蘭染色細胞計數，調整細胞濃度為1×105 cell/mL，加入200 μL/well細胞懸液于96 孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO?2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞80%匯合后，吸取上清，PBS洗2遍后，分別加入0、10、30、50、100 μg/mL的LPS（用不含血清的無色培養(yǎng)基配置），分別在培養(yǎng)3、6、9、12、18 h后每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL，PBS溶解，用孔徑0.22 mm濾膜過濾），4 h后棄掉培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，振蕩混勻，使用酶標儀于490 nm波長處測定各孔的吸光值（OD）。

細胞存活率=LPS組的OD值/對照組OD值×100%（3）

1.2.4RT-PCR檢測LPS對BEEC細胞因子基因水平表達的影響。常規(guī)培養(yǎng)細胞，經傳代3次以上，當IEC-6細胞融合率在95%以上時，用0.25%的胰酶-EDTA消化后加含15%的血清的DMEM/F12GlutaMAX完全培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)1 d后，處理前用無鈣鎂PBS洗2次。

BEEC細胞分為對照組、模型組且設定3、6、9、12 h 4個時間點。對照組，用DMEM/F12GlutaMAX培養(yǎng);模型組，先用DMEM/F12GlutaMAX培養(yǎng)2 h后，用DMEM/F12GlutaMAX配制的30 μg/mL的LPS培養(yǎng)3、6、9、12 h。選取3～5代純化后的BEEC，傳代于六孔板中，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按試驗分組的要求處理細胞。細胞處理完成后，棄去培養(yǎng)液，用無Ca2+、Mg2+的PBS洗滌2次，加入1 ?mL 預冷的Trizol，充分吹打使裂解完全，室溫放置反應5～10 min。提取RNA，加入0.1 % DEPC水20～30 μL，用槍頭緩慢吹吸或離心，使RNA溶解混勻，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｎ? μL使用核酸測定儀檢測RNA濃度，使用RNA反轉錄兩步法合成cDNA。

根據GenBank數據庫公布的牛待測基因序列，使用Primer premier 5.0和Oligo6.0軟件在其相對保守區(qū)域設計基因的特異性上下游引物，并由上海生工生物工程公司合成。引物序列見表1。引物開蓋前應先離心，慢慢打開，以防干粉狀引物散失，按照說明書要求加適量滅菌處理過的DEPC水溶解，關閉管蓋，充分振蕩5～10 min，配成100 μmol/L的貯存液，分裝后-20 ℃下保存。

RT-PCR反應體系如下：1.000 μL cDNA，1.000 μL上游引物，1.000 μL下游引物，12.500 μL Brilliant SYBR Green QPCR master Mix，0.375 μL ROX，9.125 μL DEPC水。

RT-PCR反應條件如下：95 ℃預變性10 ?min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)。溶解曲線條件如下：95 ℃ 1 min;55 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s。每個樣本至少重復3次獨立的Real-time PCR全過程。

1.2.5數據統(tǒng)計與分析。使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對試驗數據進行統(tǒng)計與分析。

2結果與分析

2.1組織塊法培養(yǎng)的BEEC和BESC

組織培養(yǎng)后一般在第4天左右開始出現組織塊邊緣變圓，基質細胞呈梭形從組織塊周圍溢出，形成“細胞暈”，在第7天呈鋪石狀的上皮細胞游出，如圖1A所示;隨著培養(yǎng)時間的延長，BESC分裂增殖，細胞連接成束，平行排列;BEEC呈多邊形，以團塊形式生長，細胞連接緊密，BESC可抑制BEEC延伸生長;如圖1B所示，箭頭所指為2種細胞生長的交界處;當細胞暈圈寬度是組織塊的半徑的1～2 倍，適合分離純化和傳代。圖1C為純化后的奶牛子宮內膜基質細胞。圖1D為純化后的奶牛子宮內膜上皮細胞。

2.2免疫組化鑒定BEEC

純化分離后的奶牛子宮內膜上皮細胞經免疫組化法檢測角蛋白的表達，如圖2所示，上皮細胞的細胞質呈紅棕色，角蛋白表達呈陽性，初步估算上皮細胞純度達95%。

2.3MTT篩選LPS作用濃度和刺激時間

如圖3所示，30 μg/mLLPS作用12 h后，BEEC活力顯著下降（P<0.05）;50 μg/mL LPS作用12、18 h后，BEEC活力極顯著下降（P<0.01）;100 μg/mL LPS作用9 h后，細胞活力顯著下降（P<0.05），作用12、18 h可以極顯著抑制BEEC活力（P<0.01）。

篩選結果表明，30 μg/mL的LPS作用12 h后BEEC活力顯著下降（P<0.05），并且隨著時間的延長，30 μg/mL及其以上的濃度刺激細胞導致細胞活力極顯著下降（P<0.01），故當LPS濃度為30 μg/mL作用BEEC 12 h時細胞活力形成明顯拐點，3次重復試驗結果一致，選定該條件作為最佳作用時間濃度。

2.4RT-PCR檢測 LPS對奶牛子宮內膜上皮細胞因子IL-1β mRNA表達的影響

由圖4可知，與對照組相比，30 μg/mLLPS作用子宮內膜上皮細胞3、6、9、12 h IL-1β的表達量均極顯著上升（P<0.01）。

2.5RT-PCR檢測LPS對奶牛子宮內膜上皮細胞因子TNF-α mRNA表達的影響

由圖5可知，與對照組相比，30 μg/mLLPS作用子宮內膜上皮細胞3、6、9、12 h TNF-α 的表達量極顯著上升（P<0.01）。

3討論

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的組成成分，是引起炎癥反應的關鍵介質之一。奶牛子宮內膜是機體抵抗侵入物的第一道防線，子宮內膜上皮細胞在阻止子宮免受感染中扮演重要的角色。因此，奶牛子宮內膜上皮細胞被廣泛用于奶牛子宮生殖生理或病理以及分子基因和蛋白水平發(fā)生發(fā)展機制的研究。為了保證細胞性狀的穩(wěn)定性，避免細胞因多次傳代而老化，故選用體外原代培養(yǎng)3～4代純度較高的奶牛子宮內膜上皮細胞（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）用于體外研究的細胞模型。通過LPS對細胞進行不同濃度和時間的刺激，探討LPS對BEEC細胞增殖能力、形態(tài)學損傷的影響，以此作為建立并評價BEEC細胞體外炎性損傷模型，進一步用于后續(xù)實驗研究。

MTT法作為檢測細胞增殖的經典方法，靈敏度高，特異性強，結果穩(wěn)定、可靠，且操作快速、簡便[7-9]。該研究中采用不含血清的無色培養(yǎng)基配置LPS，從而既避免了血清對LPS的干擾，也避免了一般培養(yǎng)液中酚紅成分對吸光度的干擾。查閱相關文獻后，經過預試驗篩選后，選取0～100 μg/mL的濃度和0～24 h作用時間的范圍內繼續(xù)篩選模型條件。結果表明，在6 h內，LPS作用劑量100 μg/mL內，對奶牛子宮內膜上皮細胞的增殖不會產生明顯的抑制作用，9 h時100 μg/mLLPS對 BEEC活力顯著下降（P<0.05），12 h時30 μg/mLLPS可以顯著抑制BEEC活力（P<0.05），30 μg/mL以上濃度的LPS刺激時間達12 h以上可以極顯著抑制細胞活力（P<0.01），結合LPS在體內所能達到最高濃度的考慮，故選取30 μg/mL、12 h作為LPS誘導BEEC炎性損傷模型條件。這與之前報道的小鼠子宮內膜細胞體外炎癥模型所用的LPS濃度為100 ng/mL差異較大，可見該炎癥模型中細胞不同，LPS 作用濃度和時間差距較大[10]。在一定程度上驗證了張桂林等關于10～100 μg/mL的LPS對奶牛子宮內膜上皮

細胞有不同程度的抑制作用且LPS作用呈濃度和時間依賴性的報道[11]。倒置顯微鏡下觀察BEEC形態(tài)學變化，30 μg/mL的LPS作用BEEC 12 h，細胞一定程度的損傷，鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現，與對照組相比模型組細胞形態(tài)學變化明顯，細胞隆起，部分細胞皺縮脫落。

LPS經脂多糖結合蛋白（LBP）/CD14的識別與調控后，形成LPS-LBP復合物，與細胞表面的CD14/TLRs受體結合，通過細胞信號傳導將信號到細胞核，激活NF-κB，進而調控炎癥網絡分子的基因轉錄與表達。NF-κB活化后可以誘導TNF-α、IL-1β等細胞因子的基因轉錄，使其產生和分泌增多，其正反饋效應可進一步激活NF-κB，進而調控IL-6、IL-8的產生和釋放[12]。NF-κB活化的同時，使IκBα、P105等抑制基因的轉錄上調。IL-1β可激活巨噬細胞、T細胞、B細胞和信號級聯(lián)反應，誘導環(huán)氧合酶-2（COX-2）和發(fā)熱反應，介導炎癥反應，造成組織損傷[13]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）因最初發(fā)現其能使腫瘤組織細胞發(fā)生出血性壞死而得名，包括TNF-α和TNF-β兩類。TNF-α主要是由活化的單核-巨噬細胞、上皮細胞等多種細胞產生，可激活巨噬細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞等功能，導致IL-1，IL-6等炎性介質的分泌，促進組織炎癥反應的進程[14]。利用30 μg/mLLPS刺激后RT-PCR檢測IL-1β mRNA表達水平顯著上升，TNF-α mRNA表達水平顯著下降，說明LPS能啟動細胞內信號傳導系統(tǒng)，引起IL-1β、TNF-α 等炎癥相關細胞因子的合成釋放，從而導致奶牛子宮內膜細胞的損傷。因此，LPS濃度30 μg/mL，刺激時間12 h作為奶牛子宮內膜上皮細胞體外炎癥損傷模型建立條件。

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