高通量技術在微生物培養(yǎng)中的應用進展及分子測序?qū)Ρ确治?/h1>
2020-09-06 14:05:19劉瑩韓錳王文磊馬成玉張沛
安徽農(nóng)業(yè)科學 2020年15期
劉瑩 韓 錳 王文磊 馬成玉 張沛
摘要高通量技術是以微型生物反應器為操作平臺，實現(xiàn)對生物細胞的分離培養(yǎng)和分子測序。通過著重分析幾種實用型高通量技術在微生物分離培養(yǎng)及分子測序中的應用進展，發(fā)現(xiàn)微包埋技術在高通量試驗中的研究及應用較為深入;而對不同環(huán)境菌樣的分離培養(yǎng)中，海洋微生物方面的應用最為突出。另外，通過對比高通量分子測序技術可以發(fā)現(xiàn)，Illumina 測序法的平均測序速度最快;單分子測序法所得數(shù)據(jù)的精確度最高，測序讀長最長，周期相對最短。最后，對高通量技術在微生物學應用中的一些不足進行總結(jié)，并提出假設性解決方法。
關鍵詞微生物;高通量技術;分離培養(yǎng);分子測序
中圖分類號Q93文獻標識碼A文章編號0517-6611（2020）15-0016-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.005
開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
Application Progress of Highthroughput Technology in Microbial Culture and Comparative Analysis of Molecular Sequencing
LIU Ying1， HAN Meng2， WANG Wenlei3 et al
（1.Henan Center for Supervision & Inspection of Grain，Oil and Feed Product Quality，Zhengzhou，Henan 450001;2.National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Huazhong Agricultural University， Wuhan，Hubei 430070;3.Nanjing Argricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095）
AbstractHighthroughput technology is based on microbioreactor to realize the separation， culture and molecular sequencing of biological cells. According to the analysis of the application of several practical highthroughput techniques in microbial isolation and culture， it was found that the micro encapsulation technology was deeply studied and applied in highthroughput experiments. The application of marine microorganism is the most prominent in the isolation and culture of bacteria samples from different environments. In addition， by comparing the highthroughput molecular sequencing technique， we can find that the Illumina sequencing method has the fastest average sequencing speed， and the single molecule sequencing method has the highest accuracy， the longest reading length and the shortest cycle. Finally， we summarized the shortcomings of highthroughput technology in microbiology， and proposed hypothetical solutions.
Key wordsMicroorganism;Highthroughput technology;Isolation and culture;Molecular sequencing
基金項目國家自然基金青年項目（31701121）;河南省科技公關項目（182102310667）;河南省高等學校重點科研項目計劃（18A180022）。
作者簡介劉瑩（1981—），女，河南安陽人，工程師，碩士，從事微生物學以及糧油食品檢驗等研究。*通信作者，講師，博士，從事納米生物材料、細胞免疫學及腸道微生物學等研究。
收稿日期2019-09-13
高通量技術已經(jīng)成為生命科學領域基礎研究和臨床中被廣泛應用的試驗技術之一[1]，其在微生物方面的應用包括對菌株的分離培養(yǎng)和分子鑒定。該方法主要是區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)與鑒定方式，運用高通量技術對不同環(huán)境下微生物進行寬領域、多種類、深層次、高效率的分離培養(yǎng)和分子測序，有效地保證所分離微生物種類的多樣性、生境的原位性和對生物信息測定的準確性。在分離培養(yǎng)方面，高通量已成功實現(xiàn)單細胞分離培養(yǎng)、模擬微生物原有生境的微生物原位富集培養(yǎng)以及對空氣中的微生物和一些環(huán)境耐受力弱或含量低的微生物的分離純化培養(yǎng)等;在分子測序方面，基于單分子簇的邊合成邊測序技術（SBS）和特有可逆終止化學反應，可實現(xiàn)對生物基因的快速測序[2-3]。主要通過對高通量分離培養(yǎng)及測序技術研究進行綜述，以期為高通量技術在微生物學和遺傳學的深入探究提供有益參考。
1微生物高通量培養(yǎng)的分類
傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術是指以平板法實現(xiàn)對環(huán)境微生物分離和純化培養(yǎng)。此方法不但對菌種的分離效率低，而且對菌體生境改變較大，更無法實現(xiàn)對拮抗型菌落和弱勢菌體的單個分離純化。高通量培養(yǎng)不僅解決了上述問題，而且可對微生物生境中毒害因子進行更為深入的探究[4-6]。
在微生物學試驗中，目前常用的高通量培養(yǎng)種類可根據(jù)培養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)方法，被分為稀釋培養(yǎng)法、微包埋培養(yǎng)法、原位富集培養(yǎng)法三大類，其中原位富集法又可細分為擴散盒高通量培養(yǎng)法、空心纖維膜室培養(yǎng)法、聚氨酯泡沫培養(yǎng)法、基質(zhì)膜法和分離芯片培養(yǎng)法等[7]。
1.1稀釋培養(yǎng)法（多孔板培養(yǎng)法）
稀釋培養(yǎng)法也稱多孔板培養(yǎng)，是采用非侵入的方式利用光學傳感器實現(xiàn)對培養(yǎng)目標生長狀況的監(jiān)控，而孔板中細胞所處位置將直接影響細胞的生長狀態(tài)。常用的細胞培養(yǎng)板有96孔、48孔、24孔、12孔和6孔等。其中應用最為廣泛的是經(jīng)Connon等[8]和Button等[9]改良后形成的48孔平板分離培養(yǎng)法，此法通過對菌樣進行極度稀釋（痕量級），再注入48孔平板中進行培養(yǎng)，可分離培養(yǎng)出菌樣中14%的菌體細胞，Rappé等[10]在稀釋培養(yǎng)的基礎上又結(jié)合熒光原位雜交技術（FISH），現(xiàn)已實現(xiàn)對0.01 μm3菌體進行分離培養(yǎng)。
現(xiàn)行的稀釋培養(yǎng)仍存在著客觀缺陷。首先，由于多孔板中四角受環(huán)境影響最大，常出現(xiàn)細胞散布不均勻而導致孔板培養(yǎng)位置的喪失。針對此問題的解決措施有：①直接放棄對周邊孔使用;②在此類孔中加入培養(yǎng)基或PBS以保護中間孔免受影響。此外，隨著菌體樣品的稀釋，一些微生物分泌的代謝產(chǎn)物也隨之被稀釋，致使有著共生關系和群體效應關系的微生物間有益或有害作用均被減弱，也會使微生物因缺少必要的異源代謝產(chǎn)物出現(xiàn)生長受抑或直接消亡。
1.2微包埋培養(yǎng)法
微包埋培養(yǎng)是利用高分子材料形成半滲透或密封的微膠囊，后應用于微生物包埋、固定化酶和藥物傳遞等領域[11]。在微包埋技術的應用發(fā)展中，Weaver等[12]最先通過油水乳化法包埋培養(yǎng)微生物和動物細胞;Gift[13]用凝膠微球來分離慢性生長的酵母;Benita[11]則對微球包埋技術作了較詳細的介紹;2000年Katsuragi等[14]證明包埋的酵母細胞可依據(jù)自身熒光性加以分選。至此，微包埋技術被廣泛應用于微生物發(fā)酵、固定化酶及藥物肝毒性的試驗研究當中，為微生物資源的開發(fā)和利用提供了新途徑。
微包埋培養(yǎng)的前提是微球制備，從微球基材到制備方法，可根據(jù)自身菌體研究的需要進行選擇。對微球選材有以下幾點要求：①基材對被培養(yǎng)生物無毒害;②微球穩(wěn)定性高、機械性強;③微球透明度高，便于觀察;④微球的容納量較大（尺寸一般在20～90 μm）;⑤微球?qū)λ囵B(yǎng)微生物的代謝危害物的抵抗力強[15]。常用制備微球的材料有海藻酸銨、卡拉膠、瓊脂、結(jié)冷膠、聚乙烯醇等，若制備的微球穩(wěn)定性能不佳，則可使用殼聚糖作為復包埋的外圍包覆材料[16]。微囊制備常用方法有乳化法、擠出法、微流體法，其中乳化法包含膜乳化和油水攪拌乳化，擠出法包括高壓靜電法、共軸氣流法、共軸液流法，微流體法包括聚合流法和混沌混合法[17-18]。表1列出了3種不同材料與方法制備的微球性能對比。
首先，對選材進行對比可以發(fā)現(xiàn)，當選用海藻酸鈉制備微球時，通過兩相共流法制備的微球性能最佳;當選用瓊脂糖制備微球時，攪拌乳化法和膜乳化法所制備的微球性能皆優(yōu)于兩相共流法;當選用結(jié)冷膠制備微球時，兩相共流法所制備的微球性能最佳。然后，從制備方法進行分析，當選用攪拌法制備微球時，利用瓊脂糖制備的微球性能良好;當選用兩相共流法制備微球時，利用結(jié)冷膠所制備的微球性能最佳;當選用膜乳化法制備微球時，選用瓊脂糖制備的微球性能最佳。由此可見，利用結(jié)冷膠所制備微球相比于其他2種材料，其均一性、透明度和機械穩(wěn)定性更佳，而利用結(jié)冷膠為基材并通過兩相共流法制備的微球質(zhì)量最好。
微包埋培養(yǎng)相對于稀釋法創(chuàng)造了微生物樣品生存的外部環(huán)境，并且微球上所存在的孔隙允許微生物間的代謝產(chǎn)物或生物分子自由出入。微包埋法既實現(xiàn)了微生物的單包埋培養(yǎng)，又通過形成的開放體系實現(xiàn)了對共生類或群體類等一些較難培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)。然而，由于該方法相對較新穎，基材選擇以及制備技術上仍存在一些問題，導致其培養(yǎng)優(yōu)勢還未得到完全發(fā)揮。如所用瓊脂糖作為微球材料，其機械強度低、透性差，并且需加熱熔解才可完成包埋，這對于大多數(shù)微生物都存在熱敏感問題[19]。此外，微球包埋法的培養(yǎng)條件與真正的原生態(tài)環(huán)境還有很多差異，均會影響對菌樣分離與培養(yǎng)的效果[20]。
1.3原位富集培養(yǎng)法
原位富集培養(yǎng)是在保證生境的原位條件下借助新型培養(yǎng)技術進行微生物富集生長，再結(jié)合傳統(tǒng)方式以實現(xiàn)對微生物分離培養(yǎng)的方法，該法能有效保護微生物群落間的相互作用。原位富集培養(yǎng)主要包括擴散盒培養(yǎng)法、空心纖維膜室培養(yǎng)法、聚氨酯泡沫培養(yǎng)法、基質(zhì)膜法等，在所有原位培養(yǎng)法中擴散盒高通量培養(yǎng)法、中空纖維膜室培養(yǎng)法以及分離芯片培養(yǎng)法的研究較為深入[19]。
1.3.1擴散盒高通量培養(yǎng)法。
Kaeberlein等[21]設計的擴散盒高通量培養(yǎng)裝置，由一個兩側(cè)膠連有厚度為0.03 μm或0.1 μm濾膜的不銹鋼鋼圈構(gòu)成。其中的濾膜可使培養(yǎng)裝置中的化學成分高效通過，而微生物細胞則被限于其內(nèi)，擴散盒借此可實現(xiàn)對菌樣的無毒培養(yǎng)并能保證培養(yǎng)菌樣間的生物信息傳遞。微生物的擴散盒高通量培養(yǎng)具備以下優(yōu)點：①擴散盒自身對微生物細胞無毒性;②擴散盒不但能夠為微生物的生長提供所需營養(yǎng)物質(zhì)和信號分子等，還可清除有害代謝產(chǎn)物，有效維護菌落間微生物相互作用。Nichols等[22]發(fā)現(xiàn)在某些環(huán)境中，對于一些弱勢菌體經(jīng)過擴散盒反復培養(yǎng)后還可使其擴增。但此培養(yǎng)方式尚存一些缺陷：擴散盒法操作復雜且分離效率低，對微生物的培養(yǎng)和分類不能同時進行。
1.3.2中空纖維膜室培養(yǎng)法。
Aoi等[23]設計的中空纖維室膜原位培養(yǎng)裝置是由中空的纖維膜形成一個單元小室，提供培養(yǎng)所需生境，再將從環(huán)境中提取的微生物樣品稀釋于腔室之中。該法在保證菌樣自然生境前提下，有效阻止各個小室內(nèi)微生物的進出，但對不同菌落間的生物信息分子無任何阻礙作用。通過此法不但可分離培養(yǎng)出新的菌型，而且為不同菌類的抗逆性或菌落間的拮抗作用提供了新思路;然而，若要進一步增加對菌樣中菌種分離的準確性，還必須借助流式細胞儀。
1.3.3分離芯片培養(yǎng)法。
分離芯片是由聚甲醛材料制成的多孔平板，將平板浸泡于菌樣液中（既可是稀釋后的菌樣液，也可是經(jīng)過微球包埋的菌樣液），待平板上的每個小孔室中分好菌體細胞后，覆膜形成密封小室進行菌體的原位培養(yǎng)[24]。
2高通量技術對不同環(huán)境微生物的應用舉例
現(xiàn)有高通量分離培養(yǎng)技術為各類環(huán)境中微生物的研究提供了廣泛的幫助，但為了更加準確且具體地展示不同環(huán)境下的微生物高通量培養(yǎng)，該研究從海洋、土壤以及空氣3種生境入手進行歸納。
2.1海洋微生物
在對海洋微生物的高通量分離培養(yǎng)中，稀釋培養(yǎng)法、微包埋法、原位富集培養(yǎng)法都可適用于海洋微生物的培養(yǎng)，其中微包埋法的應用最為普遍[7]。但對海洋微生物研究的方向不同，方法的選擇也會有所差異。如可分離出新型菌株的方法有稀釋培養(yǎng)法中的48孔平板分離法、微包埋法中的瓊脂微球包埋法以及原位富集培養(yǎng)中的中空纖維膜室培養(yǎng)和分離芯片培養(yǎng)法等，而對弱勢菌體的反復培養(yǎng)則多采用擴散盒高通量培養(yǎng)法。通過高通量分離培養(yǎng)技術對海洋微生物開展研究，意在加強對海洋生態(tài)環(huán)境的了解和保護，同時為解決水產(chǎn)水質(zhì)問題提供更多有益途徑。
2.2土壤微生物
Yasumotohirose等[25]使用浸取瓊脂培養(yǎng)基的聚氨酯泡沫培養(yǎng)法（PUF）來培養(yǎng)和分離石油降解菌、鐵載體產(chǎn)生菌以及鐵細菌等。Gavrish等[26]通過擴散盒培養(yǎng)原理實現(xiàn)了對土壤中放線菌的分離培養(yǎng)，進而廣泛用于抗生素的研發(fā)。Ferrari等[27]將對擴散盒培養(yǎng)法進行改良后建立的基質(zhì)膜法（substrate membrane）用于土壤菌的分離，進一步實現(xiàn)了對土壤菌的培養(yǎng)。此外，將土壤微生物制成濃縮菌樣后也可用微包埋法進行分離和培養(yǎng)。高通量技術對土壤微生物分離培養(yǎng)的應用意義在于可開展關于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中共生菌型、固氮菌等有益菌種的研究，也可對生活中一些病原微生物的致病機理和預防舉措進行探索以及開展一些新型抗生素類藥物的研發(fā)等。
2.3空氣微生物
在對空氣微生物的高通量分離中，Moon[28]通過微流體裝置完成了對空氣中微生物與粉塵的高通量分離?？山柚鷤鹘y(tǒng)的平板培養(yǎng)法實現(xiàn)對不同菌株的培養(yǎng)。在現(xiàn)有的研究中，高通量技術用于海洋微生物的研究較為深入，已經(jīng)實踐成功的培養(yǎng)實例較多，但對于淡水微生物、土壤微生物、空氣微生物、藥用微生物以及嗜極環(huán)境微生物的高通量培養(yǎng)尚待深入。
3高通量分子測序技術對比分析
若把20世紀70年代由Frederick Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法核酸測序技術看作第一代分子測定技術，高通量分子測序技術則是在此基礎上發(fā)展起來的第二代和第三代測序技術。其中，常用的二代測序技術有Illumina sequencing、AB Solid system sequencing、Ion Torrent sequencing、 Pyro sequenceing等，而第三代測序技術主要是Pacific Bio等，利用第二代或者第三代高通量測序技術可以更高效地完成生物分子測序[29-33]。
對表2進行對比發(fā)現(xiàn)，第一代分子測序技術和第二代高通量測序技術測序速度快、測序讀長長、測序通量大、準確度高。對第二代各類測序技術進行對比發(fā)現(xiàn)：Illumina 測序法的平均測序速度最快，該技術還可完成對多聚重復序列的測序;AB Solid system測序法[33]通過復測序方式，數(shù)據(jù)的相對精確度最高;而相對于前兩代來說，第三代測序技術的精確度最高，測序讀長最長，周期相對最短。另外，所有3代測序技術不但可實現(xiàn)對微生物基因序列的快速測定，還可直接對微生物轉(zhuǎn)錄出的RNApool序列進行測定，測序數(shù)據(jù)在短時間內(nèi)即可得到[34]。
4展望
高通量培養(yǎng)技術的興起為微生物學、遺傳學、分子生物學及藥物靶向作用的研究提供了更為寬廣的應用平臺。但目前現(xiàn)有的高通量培養(yǎng)技術尚存在完善之處，稀釋培養(yǎng)對孔板的利用率不高;利用擴增盒法無法實現(xiàn)新菌型的培養(yǎng);微球材料和制法的不足使應用受限。這些局限導致高通量分離培養(yǎng)技術在對淡水微生物、土壤微生物以及醫(yī)用微生物的培養(yǎng)應用中存在很大欠缺。針對此類問題，提出一定的假設性解決方案：①對于現(xiàn)有的高通量培養(yǎng)缺陷，可通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)方式相結(jié)合或開發(fā)新方法來彌補;②對于淡水微生物的高通量培養(yǎng)，可依照海洋微生物的培養(yǎng)技術進行改進和運用，對于土壤及醫(yī)用微生物的高通量培養(yǎng)則可依據(jù)菌樣的大致種類進行針對性的分種類高通量培養(yǎng)。
高通量技術不僅成功應用于不同環(huán)境的微生物分離與擴增，以及大量形態(tài)學的試驗研究，而且還作為新一代測序技術來發(fā)現(xiàn)基因組和轉(zhuǎn)錄組上所有可能的細微差異，即利用單堿基的精確度去更加深入地理解微生物世界，探尋微生物生存和演化過程中留下的痕跡[35]?？傊?，通過高通量分離培養(yǎng)技術，完成對不同環(huán)境下菌體的純培養(yǎng)，再結(jié)合現(xiàn)有的生物分子測序技術，從微生物分類學到基因組學再深入到轉(zhuǎn)錄組學和宏基因組學等方面。微生物的整體研究將由淺及深，也將更為系統(tǒng)與全面，同時期待高通量技術在未來微生物學試驗中發(fā)揮更大的作用。
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劉瑩 韓 錳 王文磊 馬成玉 張沛
摘要高通量技術是以微型生物反應器為操作平臺，實現(xiàn)對生物細胞的分離培養(yǎng)和分子測序。通過著重分析幾種實用型高通量技術在微生物分離培養(yǎng)及分子測序中的應用進展，發(fā)現(xiàn)微包埋技術在高通量試驗中的研究及應用較為深入;而對不同環(huán)境菌樣的分離培養(yǎng)中，海洋微生物方面的應用最為突出。另外，通過對比高通量分子測序技術可以發(fā)現(xiàn)，Illumina 測序法的平均測序速度最快;單分子測序法所得數(shù)據(jù)的精確度最高，測序讀長最長，周期相對最短。最后，對高通量技術在微生物學應用中的一些不足進行總結(jié)，并提出假設性解決方法。
關鍵詞微生物;高通量技術;分離培養(yǎng);分子測序
中圖分類號Q93文獻標識碼A文章編號0517-6611（2020）15-0016-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.005
開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：
Application Progress of Highthroughput Technology in Microbial Culture and Comparative Analysis of Molecular Sequencing
LIU Ying1， HAN Meng2， WANG Wenlei3 et al
（1.Henan Center for Supervision & Inspection of Grain，Oil and Feed Product Quality，Zhengzhou，Henan 450001;2.National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Huazhong Agricultural University， Wuhan，Hubei 430070;3.Nanjing Argricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095）
AbstractHighthroughput technology is based on microbioreactor to realize the separation， culture and molecular sequencing of biological cells. According to the analysis of the application of several practical highthroughput techniques in microbial isolation and culture， it was found that the micro encapsulation technology was deeply studied and applied in highthroughput experiments. The application of marine microorganism is the most prominent in the isolation and culture of bacteria samples from different environments. In addition， by comparing the highthroughput molecular sequencing technique， we can find that the Illumina sequencing method has the fastest average sequencing speed， and the single molecule sequencing method has the highest accuracy， the longest reading length and the shortest cycle. Finally， we summarized the shortcomings of highthroughput technology in microbiology， and proposed hypothetical solutions.
Key wordsMicroorganism;Highthroughput technology;Isolation and culture;Molecular sequencing
基金項目國家自然基金青年項目（31701121）;河南省科技公關項目（182102310667）;河南省高等學校重點科研項目計劃（18A180022）。
作者簡介劉瑩（1981—），女，河南安陽人，工程師，碩士，從事微生物學以及糧油食品檢驗等研究。*通信作者，講師，博士，從事納米生物材料、細胞免疫學及腸道微生物學等研究。
收稿日期2019-09-13
高通量技術已經(jīng)成為生命科學領域基礎研究和臨床中被廣泛應用的試驗技術之一[1]，其在微生物方面的應用包括對菌株的分離培養(yǎng)和分子鑒定。該方法主要是區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)與鑒定方式，運用高通量技術對不同環(huán)境下微生物進行寬領域、多種類、深層次、高效率的分離培養(yǎng)和分子測序，有效地保證所分離微生物種類的多樣性、生境的原位性和對生物信息測定的準確性。在分離培養(yǎng)方面，高通量已成功實現(xiàn)單細胞分離培養(yǎng)、模擬微生物原有生境的微生物原位富集培養(yǎng)以及對空氣中的微生物和一些環(huán)境耐受力弱或含量低的微生物的分離純化培養(yǎng)等;在分子測序方面，基于單分子簇的邊合成邊測序技術（SBS）和特有可逆終止化學反應，可實現(xiàn)對生物基因的快速測序[2-3]。主要通過對高通量分離培養(yǎng)及測序技術研究進行綜述，以期為高通量技術在微生物學和遺傳學的深入探究提供有益參考。
1微生物高通量培養(yǎng)的分類
傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術是指以平板法實現(xiàn)對環(huán)境微生物分離和純化培養(yǎng)。此方法不但對菌種的分離效率低，而且對菌體生境改變較大，更無法實現(xiàn)對拮抗型菌落和弱勢菌體的單個分離純化。高通量培養(yǎng)不僅解決了上述問題，而且可對微生物生境中毒害因子進行更為深入的探究[4-6]。
在微生物學試驗中，目前常用的高通量培養(yǎng)種類可根據(jù)培養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)方法，被分為稀釋培養(yǎng)法、微包埋培養(yǎng)法、原位富集培養(yǎng)法三大類，其中原位富集法又可細分為擴散盒高通量培養(yǎng)法、空心纖維膜室培養(yǎng)法、聚氨酯泡沫培養(yǎng)法、基質(zhì)膜法和分離芯片培養(yǎng)法等[7]。
1.1稀釋培養(yǎng)法（多孔板培養(yǎng)法）
稀釋培養(yǎng)法也稱多孔板培養(yǎng)，是采用非侵入的方式利用光學傳感器實現(xiàn)對培養(yǎng)目標生長狀況的監(jiān)控，而孔板中細胞所處位置將直接影響細胞的生長狀態(tài)。常用的細胞培養(yǎng)板有96孔、48孔、24孔、12孔和6孔等。其中應用最為廣泛的是經(jīng)Connon等[8]和Button等[9]改良后形成的48孔平板分離培養(yǎng)法，此法通過對菌樣進行極度稀釋（痕量級），再注入48孔平板中進行培養(yǎng)，可分離培養(yǎng)出菌樣中14%的菌體細胞，Rappé等[10]在稀釋培養(yǎng)的基礎上又結(jié)合熒光原位雜交技術（FISH），現(xiàn)已實現(xiàn)對0.01 μm3菌體進行分離培養(yǎng)。
現(xiàn)行的稀釋培養(yǎng)仍存在著客觀缺陷。首先，由于多孔板中四角受環(huán)境影響最大，常出現(xiàn)細胞散布不均勻而導致孔板培養(yǎng)位置的喪失。針對此問題的解決措施有：①直接放棄對周邊孔使用;②在此類孔中加入培養(yǎng)基或PBS以保護中間孔免受影響。此外，隨著菌體樣品的稀釋，一些微生物分泌的代謝產(chǎn)物也隨之被稀釋，致使有著共生關系和群體效應關系的微生物間有益或有害作用均被減弱，也會使微生物因缺少必要的異源代謝產(chǎn)物出現(xiàn)生長受抑或直接消亡。
1.2微包埋培養(yǎng)法
微包埋培養(yǎng)是利用高分子材料形成半滲透或密封的微膠囊，后應用于微生物包埋、固定化酶和藥物傳遞等領域[11]。在微包埋技術的應用發(fā)展中，Weaver等[12]最先通過油水乳化法包埋培養(yǎng)微生物和動物細胞;Gift[13]用凝膠微球來分離慢性生長的酵母;Benita[11]則對微球包埋技術作了較詳細的介紹;2000年Katsuragi等[14]證明包埋的酵母細胞可依據(jù)自身熒光性加以分選。至此，微包埋技術被廣泛應用于微生物發(fā)酵、固定化酶及藥物肝毒性的試驗研究當中，為微生物資源的開發(fā)和利用提供了新途徑。
微包埋培養(yǎng)的前提是微球制備，從微球基材到制備方法，可根據(jù)自身菌體研究的需要進行選擇。對微球選材有以下幾點要求：①基材對被培養(yǎng)生物無毒害;②微球穩(wěn)定性高、機械性強;③微球透明度高，便于觀察;④微球的容納量較大（尺寸一般在20～90 μm）;⑤微球?qū)λ囵B(yǎng)微生物的代謝危害物的抵抗力強[15]。常用制備微球的材料有海藻酸銨、卡拉膠、瓊脂、結(jié)冷膠、聚乙烯醇等，若制備的微球穩(wěn)定性能不佳，則可使用殼聚糖作為復包埋的外圍包覆材料[16]。微囊制備常用方法有乳化法、擠出法、微流體法，其中乳化法包含膜乳化和油水攪拌乳化，擠出法包括高壓靜電法、共軸氣流法、共軸液流法，微流體法包括聚合流法和混沌混合法[17-18]。表1列出了3種不同材料與方法制備的微球性能對比。
首先，對選材進行對比可以發(fā)現(xiàn)，當選用海藻酸鈉制備微球時，通過兩相共流法制備的微球性能最佳;當選用瓊脂糖制備微球時，攪拌乳化法和膜乳化法所制備的微球性能皆優(yōu)于兩相共流法;當選用結(jié)冷膠制備微球時，兩相共流法所制備的微球性能最佳。然后，從制備方法進行分析，當選用攪拌法制備微球時，利用瓊脂糖制備的微球性能良好;當選用兩相共流法制備微球時，利用結(jié)冷膠所制備的微球性能最佳;當選用膜乳化法制備微球時，選用瓊脂糖制備的微球性能最佳。由此可見，利用結(jié)冷膠所制備微球相比于其他2種材料，其均一性、透明度和機械穩(wěn)定性更佳，而利用結(jié)冷膠為基材并通過兩相共流法制備的微球質(zhì)量最好。
微包埋培養(yǎng)相對于稀釋法創(chuàng)造了微生物樣品生存的外部環(huán)境，并且微球上所存在的孔隙允許微生物間的代謝產(chǎn)物或生物分子自由出入。微包埋法既實現(xiàn)了微生物的單包埋培養(yǎng)，又通過形成的開放體系實現(xiàn)了對共生類或群體類等一些較難培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)。然而，由于該方法相對較新穎，基材選擇以及制備技術上仍存在一些問題，導致其培養(yǎng)優(yōu)勢還未得到完全發(fā)揮。如所用瓊脂糖作為微球材料，其機械強度低、透性差，并且需加熱熔解才可完成包埋，這對于大多數(shù)微生物都存在熱敏感問題[19]。此外，微球包埋法的培養(yǎng)條件與真正的原生態(tài)環(huán)境還有很多差異，均會影響對菌樣分離與培養(yǎng)的效果[20]。
1.3原位富集培養(yǎng)法
原位富集培養(yǎng)是在保證生境的原位條件下借助新型培養(yǎng)技術進行微生物富集生長，再結(jié)合傳統(tǒng)方式以實現(xiàn)對微生物分離培養(yǎng)的方法，該法能有效保護微生物群落間的相互作用。原位富集培養(yǎng)主要包括擴散盒培養(yǎng)法、空心纖維膜室培養(yǎng)法、聚氨酯泡沫培養(yǎng)法、基質(zhì)膜法等，在所有原位培養(yǎng)法中擴散盒高通量培養(yǎng)法、中空纖維膜室培養(yǎng)法以及分離芯片培養(yǎng)法的研究較為深入[19]。
1.3.1擴散盒高通量培養(yǎng)法。
Kaeberlein等[21]設計的擴散盒高通量培養(yǎng)裝置，由一個兩側(cè)膠連有厚度為0.03 μm或0.1 μm濾膜的不銹鋼鋼圈構(gòu)成。其中的濾膜可使培養(yǎng)裝置中的化學成分高效通過，而微生物細胞則被限于其內(nèi)，擴散盒借此可實現(xiàn)對菌樣的無毒培養(yǎng)并能保證培養(yǎng)菌樣間的生物信息傳遞。微生物的擴散盒高通量培養(yǎng)具備以下優(yōu)點：①擴散盒自身對微生物細胞無毒性;②擴散盒不但能夠為微生物的生長提供所需營養(yǎng)物質(zhì)和信號分子等，還可清除有害代謝產(chǎn)物，有效維護菌落間微生物相互作用。Nichols等[22]發(fā)現(xiàn)在某些環(huán)境中，對于一些弱勢菌體經(jīng)過擴散盒反復培養(yǎng)后還可使其擴增。但此培養(yǎng)方式尚存一些缺陷：擴散盒法操作復雜且分離效率低，對微生物的培養(yǎng)和分類不能同時進行。
1.3.2中空纖維膜室培養(yǎng)法。
Aoi等[23]設計的中空纖維室膜原位培養(yǎng)裝置是由中空的纖維膜形成一個單元小室，提供培養(yǎng)所需生境，再將從環(huán)境中提取的微生物樣品稀釋于腔室之中。該法在保證菌樣自然生境前提下，有效阻止各個小室內(nèi)微生物的進出，但對不同菌落間的生物信息分子無任何阻礙作用。通過此法不但可分離培養(yǎng)出新的菌型，而且為不同菌類的抗逆性或菌落間的拮抗作用提供了新思路;然而，若要進一步增加對菌樣中菌種分離的準確性，還必須借助流式細胞儀。
1.3.3分離芯片培養(yǎng)法。
分離芯片是由聚甲醛材料制成的多孔平板，將平板浸泡于菌樣液中（既可是稀釋后的菌樣液，也可是經(jīng)過微球包埋的菌樣液），待平板上的每個小孔室中分好菌體細胞后，覆膜形成密封小室進行菌體的原位培養(yǎng)[24]。
2高通量技術對不同環(huán)境微生物的應用舉例
現(xiàn)有高通量分離培養(yǎng)技術為各類環(huán)境中微生物的研究提供了廣泛的幫助，但為了更加準確且具體地展示不同環(huán)境下的微生物高通量培養(yǎng)，該研究從海洋、土壤以及空氣3種生境入手進行歸納。
2.1海洋微生物
在對海洋微生物的高通量分離培養(yǎng)中，稀釋培養(yǎng)法、微包埋法、原位富集培養(yǎng)法都可適用于海洋微生物的培養(yǎng)，其中微包埋法的應用最為普遍[7]。但對海洋微生物研究的方向不同，方法的選擇也會有所差異。如可分離出新型菌株的方法有稀釋培養(yǎng)法中的48孔平板分離法、微包埋法中的瓊脂微球包埋法以及原位富集培養(yǎng)中的中空纖維膜室培養(yǎng)和分離芯片培養(yǎng)法等，而對弱勢菌體的反復培養(yǎng)則多采用擴散盒高通量培養(yǎng)法。通過高通量分離培養(yǎng)技術對海洋微生物開展研究，意在加強對海洋生態(tài)環(huán)境的了解和保護，同時為解決水產(chǎn)水質(zhì)問題提供更多有益途徑。
2.2土壤微生物
Yasumotohirose等[25]使用浸取瓊脂培養(yǎng)基的聚氨酯泡沫培養(yǎng)法（PUF）來培養(yǎng)和分離石油降解菌、鐵載體產(chǎn)生菌以及鐵細菌等。Gavrish等[26]通過擴散盒培養(yǎng)原理實現(xiàn)了對土壤中放線菌的分離培養(yǎng)，進而廣泛用于抗生素的研發(fā)。Ferrari等[27]將對擴散盒培養(yǎng)法進行改良后建立的基質(zhì)膜法（substrate membrane）用于土壤菌的分離，進一步實現(xiàn)了對土壤菌的培養(yǎng)。此外，將土壤微生物制成濃縮菌樣后也可用微包埋法進行分離和培養(yǎng)。高通量技術對土壤微生物分離培養(yǎng)的應用意義在于可開展關于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中共生菌型、固氮菌等有益菌種的研究，也可對生活中一些病原微生物的致病機理和預防舉措進行探索以及開展一些新型抗生素類藥物的研發(fā)等。
2.3空氣微生物
在對空氣微生物的高通量分離中，Moon[28]通過微流體裝置完成了對空氣中微生物與粉塵的高通量分離?？山柚鷤鹘y(tǒng)的平板培養(yǎng)法實現(xiàn)對不同菌株的培養(yǎng)。在現(xiàn)有的研究中，高通量技術用于海洋微生物的研究較為深入，已經(jīng)實踐成功的培養(yǎng)實例較多，但對于淡水微生物、土壤微生物、空氣微生物、藥用微生物以及嗜極環(huán)境微生物的高通量培養(yǎng)尚待深入。
3高通量分子測序技術對比分析
若把20世紀70年代由Frederick Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法核酸測序技術看作第一代分子測定技術，高通量分子測序技術則是在此基礎上發(fā)展起來的第二代和第三代測序技術。其中，常用的二代測序技術有Illumina sequencing、AB Solid system sequencing、Ion Torrent sequencing、 Pyro sequenceing等，而第三代測序技術主要是Pacific Bio等，利用第二代或者第三代高通量測序技術可以更高效地完成生物分子測序[29-33]。
對表2進行對比發(fā)現(xiàn)，第一代分子測序技術和第二代高通量測序技術測序速度快、測序讀長長、測序通量大、準確度高。對第二代各類測序技術進行對比發(fā)現(xiàn)：Illumina 測序法的平均測序速度最快，該技術還可完成對多聚重復序列的測序;AB Solid system測序法[33]通過復測序方式，數(shù)據(jù)的相對精確度最高;而相對于前兩代來說，第三代測序技術的精確度最高，測序讀長最長，周期相對最短。另外，所有3代測序技術不但可實現(xiàn)對微生物基因序列的快速測定，還可直接對微生物轉(zhuǎn)錄出的RNApool序列進行測定，測序數(shù)據(jù)在短時間內(nèi)即可得到[34]。
4展望
高通量培養(yǎng)技術的興起為微生物學、遺傳學、分子生物學及藥物靶向作用的研究提供了更為寬廣的應用平臺。但目前現(xiàn)有的高通量培養(yǎng)技術尚存在完善之處，稀釋培養(yǎng)對孔板的利用率不高;利用擴增盒法無法實現(xiàn)新菌型的培養(yǎng);微球材料和制法的不足使應用受限。這些局限導致高通量分離培養(yǎng)技術在對淡水微生物、土壤微生物以及醫(yī)用微生物的培養(yǎng)應用中存在很大欠缺。針對此類問題，提出一定的假設性解決方案：①對于現(xiàn)有的高通量培養(yǎng)缺陷，可通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)方式相結(jié)合或開發(fā)新方法來彌補;②對于淡水微生物的高通量培養(yǎng)，可依照海洋微生物的培養(yǎng)技術進行改進和運用，對于土壤及醫(yī)用微生物的高通量培養(yǎng)則可依據(jù)菌樣的大致種類進行針對性的分種類高通量培養(yǎng)。
高通量技術不僅成功應用于不同環(huán)境的微生物分離與擴增，以及大量形態(tài)學的試驗研究，而且還作為新一代測序技術來發(fā)現(xiàn)基因組和轉(zhuǎn)錄組上所有可能的細微差異，即利用單堿基的精確度去更加深入地理解微生物世界，探尋微生物生存和演化過程中留下的痕跡[35]?？傊?，通過高通量分離培養(yǎng)技術，完成對不同環(huán)境下菌體的純培養(yǎng)，再結(jié)合現(xiàn)有的生物分子測序技術，從微生物分類學到基因組學再深入到轉(zhuǎn)錄組學和宏基因組學等方面。微生物的整體研究將由淺及深，也將更為系統(tǒng)與全面，同時期待高通量技術在未來微生物學試驗中發(fā)揮更大的作用。
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