雷 霞，張文森，薛 慧，張 寧，肖洪彬

（黑龍江省中藥健康保健產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

中藥知母為百合科植物（Anemarrhena asphodeloides Bge.）知母的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)。功效清熱瀉火，滋陰潤燥[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)水提醇沉法制備的知母粗多糖具有潤腸通便功能，特別是鹽制知母多糖出膏率明顯增加，通便功能更強[2]。從知母中提取得到了較高純度的多糖組分，并且分離得出4種知母均一多糖，分子量分別為147萬、161萬、216萬、276萬和530萬，單糖組成為：鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖或鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖。在濃縮知母水煎液時，我們發(fā)現(xiàn)濃縮液顏色明顯加深，并產(chǎn)生濃烈的芳香氣味[3]。因知母中含有多種氨基酸，如色氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等[4]；知母還含有多種還原糖[5]，由于還原糖和氨基酸是美拉德反應(yīng)的底物，我們推測在這個過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)[6]。美拉德（Maillaed）反應(yīng)是在1912年由美拉德在進(jìn)行試驗的過程中，發(fā)現(xiàn)甘氨酸與葡萄糖混合共熱時二者均發(fā)生了反應(yīng)，故稱為美拉德反應(yīng)。其中間生成物5-HMF（5-羥甲基糠醛）的積累與美拉德反應(yīng)速度密切相關(guān)，因此，可以將實驗過程中5-HMF的含量變化作為預(yù)測美拉德反應(yīng)速度的重要指標(biāo)之一[8]。本文利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 對知母在濃縮過程中其揮發(fā)性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，同時利用高效液相色譜法對5-HMF進(jìn)行檢測，結(jié)合氨基酸種類和還原糖含量的變化，探討美拉德反應(yīng)及其影響因素。

1 材料

1.1 儀器

KQ5200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；7890A－5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent）。

1.2 試劑

葡萄糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）；H2SO4（沈陽市華東試劑廠）；苯酚（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；冰乙酸（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；無水乙酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；水合茚三酮（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；L-白氨酸（M-中國惠世生化試劑有限公司）；乙醇（95%）（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

1.3 藥材

知母生藥材由世一堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院中藥鑒定教研室陳效忠教授鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。

2 方法

2.1 知母水煎液的濃縮

取知母藥材飲片1kg，加8倍量水浸泡60min，水煎煮提取3次，每次40min，8層紗布過濾，合并濾液，減壓濃縮。取 30、60、90、120、150、180min 濃縮液樣品分別裝入試管，密度計測密度，加塞后分別置于60、70、80和 90℃的恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫加熱30～150min，反應(yīng)結(jié)束后冰水水浴進(jìn)行冷卻。待檢液在4℃，13000r·min-1，10min 的條件下離心，各取上清液保存待檢。

2.2 游離氨基酸含量測定

根據(jù)黃松[11]用茚三酮比色法測量青天葵中氨基酸含量的方法，測量知母中氨基酸含量。分別以游離氨基酸含量做橫坐標(biāo)，570nm處吸光值做縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0289x+0.3618。

2.3 總糖含量測定

同 2.1。4℃離心，4000r·min-1，15min；再用 50mL蒸餾水洗一次，離心，兩次上清液合并，定容至100mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取5mL具塞試管，分別配制梯度濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的葡萄糖對照品標(biāo)準(zhǔn)液1mL。加入苯酚硫酸液2mL，混合，煮沸10min，冷卻后定容至50mL，在540nm波長下測定吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

另取5mL具塞刻度試管，分別加入上述提取得到的樣品還原糖待測液1mL，加入顯色劑2mL，按上述方法進(jìn)行實驗。測定各樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)的葡萄糖含量，計算樣品中還原糖的質(zhì)量百分含量（以葡萄糖計）。

2.4 5-HMF含量測定

將待檢液用去離子水進(jìn)行定容至5mL進(jìn)行HPLC檢測，進(jìn)樣前先用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（體積比為5∶95）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：285nm；進(jìn)樣量 5μL。

2.5 GC-MS分析香氣成分

取待測液用無水Na2SO4進(jìn)行處理。

氣相色譜條件：色譜柱為石英毛細(xì)管柱DB-17（60m×250μm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度 250℃；載氣流量：1.2mL·min-1，分流比：30∶1，進(jìn)樣量：1μL（正己烷液）。升溫程序：初始柱溫45℃，以4℃·min-1升到140℃，再以5℃·min-1升到220℃保持2min，再以25℃·min-1升到 320℃，保持 5min。質(zhì)譜條件：電離方式 EI，電子轟擊能量：70eV，離子源溫度：230℃，四級桿溫度：150℃，溶劑延遲：6min，掃描范圍：全掃描，碰撞氣體：高純 He（99.999%）。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同時間、溫度、濃度下知母濃縮液糖、氨基酸含量

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以吸光度A對葡萄糖質(zhì)量X做線性回歸，得到回歸方程：y=10.263x+0.0093，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，線性良好。

精密度實驗 取同一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)測定10次，其吸光度平均值為0.483，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.21%，說明儀器精確度良好。

表1 不同提取條件對知母氨基酸、還原糖含量變化的影響Tab.1 Effects of free amino acid and glucose content treated by different conditions in AA

重復(fù)性實驗 取同一批樣品3份，進(jìn)行重復(fù)實驗，結(jié)果RSD為0.63%，表明該實驗的重復(fù)性良好。

知母水提物在濃縮過程中，隨著濃度加大，氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。隨著時間延長，氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，60～90min時下降最快。隨著溫度升高，氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。溫度為60℃，時間為150min開始出現(xiàn)顯著降低。

表2 氨基酸含量主體間效應(yīng)的檢驗Tab.2 Test of Intersubjective effect of amino acid content

表3 葡萄糖含量主體間效應(yīng)的檢驗Tab.3 Testing of intersubjective effects of glucose content

3.2 不同提取條件下5-HMF含量

選擇0.2和0.5g·mL-1兩個濃度，在不同溫度下對產(chǎn)物5-HMF進(jìn)行定量分析。知母因提取溫度升高，平均動能越大，分子熱運動的程度越劇烈。結(jié)果顯示，5-HMF含量隨提取溫度升高逐漸降低，在60、70℃時含量顯著高于80℃，說明60℃就已經(jīng)發(fā)生美拉德反應(yīng)，程度較劇烈，反而過高的溫度下未檢測到大量的5-HMF。

3.3 香味成分的鑒定

GC-MS檢測到揮發(fā)性物質(zhì)12種，鑒定出的化合物有：4-溴-2,5-二甲氧基苯丙胺、3-糠醛、糠醛、DL-丙氨酰-DL-纈氨酸、苯丙胺、2-氨基-6甲基庚烷、檸檬烯、2,5-二甲氧基-4-（甲磺酰）苯基、丙酮胺、丙酰胺、2-氯-4-喹啉甲酸、2-丙烯醛。

圖2 知母濃縮液中揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components in anemarrhena concentrate

以下是對知母這些化合物進(jìn)行的成分鑒定，根據(jù)面積歸一化法比較其相對含量。

表3 知母濃縮液中揮發(fā)性成分的鑒定Tab.3 Identification of volatile components in Anemarrhena concentrate

4 討論

1912年法國著名食品化學(xué)家Louis-Camille Maillard首次將甘氨酸和葡萄糖混合共熱時發(fā)現(xiàn)混合液有氣味香甜，因此，被命名為美拉德反應(yīng)[9]。該反應(yīng)在食品化學(xué)工藝上有非常重要的價值，但在中藥加工炮制中的研究較少。然而許多中藥都含有氨基酸和糖類，這些是美拉德反應(yīng)必不可少的反應(yīng)底物。而且在提取、濃縮、炮制過程伴隨著氣味和顏色改變，產(chǎn)生特殊的香味和顏色，某些已經(jīng)被證實屬于美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)新生產(chǎn)物改變了中藥的口感和成分，特別是生成具有抗氧化作用的物質(zhì)，甚或是有毒物質(zhì)[10]。

本課題通過采用L9（34）正交實驗設(shè)計考察濃度、時間、溫度對濃縮過程的影響，發(fā)現(xiàn)知母在濃縮過程中還原糖含量、氨基酸含量顯著受濃度和煎煮時間的影響，在0.2g·mL-1濃度，40min時糖和氨基酸顯著下降，0.5g·mL-1和90min時糖和氨基酸含量降至最低。知母水提物濃縮過程中濃度增加，配合合適的溫度，糖和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生了美拉德化學(xué)反應(yīng)。這種反應(yīng)的存在會引起藥物原有成分遭到破壞，療效降低，而且新生產(chǎn)物可能產(chǎn)生其他未知的功效或副作用。

我們接下來采用UPLC-MS法考察美拉德反應(yīng)相對劇烈的兩個濃度下改變溫度時產(chǎn)物變化，檢測到在不同條件下濃縮液中5-HMF的含量有所不同。5-羥甲基糠醛、晚期糖基化終產(chǎn)物、丙烯酰胺等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有微毒，這些化合物被證明可能與許多慢性退行性疾病存在關(guān)系，如白內(nèi)障、阿爾茨海默病、糖尿病、尿毒癥以及人體的衰老等。甘味藥在臨床常用中藥中所占的比例較高，且以糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)等化合物含量相對較高，在合適的溫度和濃度下加工就會產(chǎn)生5-HMF。

最后，本文對知母濃縮過程中美拉德反應(yīng)最為劇烈的條件（0.3g·mL-1、70℃、60min)下得到濃縮液采用GC-MC分析，檢測出22種化學(xué)成分，18個匹配度在90%以上的化合物被鑒定。這些已鑒定的化合物中，峰面積之和占總峰面積的96.218%。主要成分為亞油酸（3%）、棕櫚酸（25.1%）、丁香酚（5.7%）、已醛（15.9%）、乙酸異戊酯（15.0%）等，其余成分相對含量較低，其余占總含量超過百分之一的成分有硬脂酸，油酸、龍腦、正戊基呋喃、二十七烷和二十九烷等[3]。棕櫚酸、亞油酸、油酸等脂肪酸類成分，具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集及血栓形成等作用。而乙酸異戊酯用作溶劑配制多種香精，用于食品、保潔用品等多種行業(yè)，有一定的呼吸道刺激，低毒。已醛用作增塑劑，以及橡膠、樹脂、殺蟲劑的有機合成，無論吸入、口服或經(jīng)皮膚吸收后都會產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。

綜上所述，知母在前煮過程中應(yīng)當(dāng)按照藥材吸水率加水，加水量過多時在正常時間內(nèi)無法達(dá)到預(yù)期濃度，濃縮過程過長便會產(chǎn)生美拉德反應(yīng)。這也提示我們，藥品生產(chǎn)制造中，中藥提取濃縮的環(huán)節(jié)是非常重要和需要規(guī)范的，分析和研究中藥提取濃縮過程對于提高我國中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的科技水平、生產(chǎn)效率和節(jié)約資源等都具有重要意義。這需要引起臨床藥師、臨床中醫(yī)師和家庭自行煎藥患者的足夠重視。

5 結(jié)論

課題組前期對知母多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)計，擬得到純度高、活性好的多糖組分。本研究結(jié)果表明，知母長時間的濃縮過程中存在美拉德反應(yīng)，60～70℃反應(yīng)最劇烈，低濃度下反應(yīng)溫和，濃度越高越劇烈。所以，單純增加溶劑提高多糖提取效率是需要慎重考慮的，濃縮過程更應(yīng)注意溫度和濃度的交互作用關(guān)系。