韓林靜 吳克亮 王宏波 肖慶華 張震 朱建宗 林曉生*

1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405

2.深圳寶安第二人民醫(yī)院(集團)總醫(yī)院，廣東 深圳 518104

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨密度降低，引起骨脆性增加、易發(fā)骨折為特征的全身性代謝性骨病[1]。其發(fā)病率與年齡呈正相關關系[2]。隨著人口老齡化程度的不斷加劇，OP在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)成為繼心血管疾病、糖尿病之后發(fā)病率排第三的慢性疾病。據(jù)相關研究[3]報道，我國40歲以上人群OP發(fā)病率約為25%，預計到2050年，我國OP患者將達到2.12億，嚴重影響我國人民的身體健康。

黃芪為常用補氣藥，性味甘微溫，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為“上品”，具有補正氣、壯脾胃等功效。OP的病位在腎、脾及經(jīng)絡，腎虛是發(fā)生OP的根本原因，脾虛是其發(fā)展的誘導因素。脾虛不能運化水谷，水谷之精不能充養(yǎng)先天腎精，筋骨失養(yǎng)加速骨質(zhì)疏松的發(fā)生。補脾益氣是防治骨質(zhì)疏松的基本法則之一，因此在OP的防治組方中，黃芪作為基礎藥物存在，據(jù)統(tǒng)計[4]，黃芪的組方使用頻率位列第三位。大量研究表明[5-10]，黃芪內(nèi)的活性成分能夠多通路促進成骨細胞的增殖與分化，提高成骨細胞活性，并能通過雌激素通路抑制破骨細胞重吸收，改善骨質(zhì)疏松，但對于黃芪抗OP的具體機仍不十分明確。因此，對黃芪的有效成分、作用機制進行微觀分析，將有利于黃芪的進一步開發(fā)利用，也為從補脾法入手治療骨質(zhì)疏松癥提供可能的理論依據(jù)。

網(wǎng)絡藥理學(network pharmacology)是由英國的Hopkins在2007年提出的，其基本原理主要是通過高通量成分篩選、分子交換驗證、結合網(wǎng)絡分析等技術揭露并構建“藥物-靶點-基因-疾病”之間復雜的網(wǎng)絡關系，同時分析、預測藥物的可能作用機制，最終結合相應的實驗來檢驗模擬預測的機制。該理念打破了傳統(tǒng)的“單個藥物-單個靶點-單個疾病”的思想，是一種先進的、系統(tǒng)的研究思想。

1 材料與方法

1.1 黃芪成分及潛在靶點獲取

通過中藥藥理學系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫 (traditional Chinese medicine system pharmacology,TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索黃芪的化學成分，按口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30及類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18進行篩選[11-13]，并將篩選結果在TCMSP數(shù)據(jù)庫逐一進行作用蛋白靶點預測提取。

1.2 靶點名稱標椎化

將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選所得所有蛋白靶點名導入UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)，設置物種為人類(Human)，篩選作用人類蛋白靶點名并轉(zhuǎn)換成標椎的基因名。

1.3 疾病靶點獲取

通過GeneCards(https://www.genecards.org)及OMIM在線數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)，輸入“Osteoporosis”，“Osteopenia”進行搜索與骨質(zhì)疏松癥相關的基因，設置關聯(lián)分數(shù)(Relevance score)≥10，結果導出為Excel文件。

1.4 抗OP活性成分篩選

將人類靶點的基因名與疾病相關基因名進行對比匹配處理，共同靶標結果就是黃芪治療骨質(zhì)疏松癥的關鍵靶點基因，反向篩選出抗OP潛在活性成分，并使用R軟件(Version R x64 3.5.1)繪制維恩圖。

1.5 黃芪-活性成分-基因靶點-疾病網(wǎng)絡構建

將活性成分、基因靶點導入Cytoscope 3.7.0，構建藥物-活性成分-靶點基因-疾病可視化網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中節(jié)點(node)代表疾病、藥物、靶點基因、活性成分；邊(edge)用來連接疾病與基因、基因與活性成分、活性成分與藥物的關系，節(jié)點的大小與連接度值呈正相關關系。

1.6 蛋白靶點互作(PPI)網(wǎng)絡建立

將黃芪抗OP關鍵靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl，Version11.0)，設置物種為人類(Homo spaiens)進行構建，設置可信度為中等可信(medium confidence)，隱藏未連接的節(jié)點，其他參數(shù)數(shù)據(jù)庫保持系統(tǒng)推薦設置，進行蛋白互作分析，獲取蛋白互作關系網(wǎng)絡。

1.7 GO生物過程與KEGG富集分析及通路建立

將關鍵靶點基因輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp，Version6.8)，選擇物種為人類(Homo spaiens)，進行GO生物過程(gene ontology-biological process，GO-BP)分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集，以P<0.05進行靶基因篩選，分析黃芪發(fā)揮藥理作用的生物過程及主要信號通路。

2 結果

2.1 黃芪的主要成分及潛在靶點獲取

依據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的標椎，篩選出黃芪的主要化學成分有20種，其中M374未匹配到到靶點，見表1。去除重復，共預測到潛在靶點218個，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標椎基因名轉(zhuǎn)換后，共得到180個作用人類的基因靶點。通過Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫共檢索到與OP相關基因199個，相匹配映射得到黃芪抗OP靶點共22個，見圖1。

表1 黃芪的主要成分及其OB和DL值Table 1 The main components of Astragalus and its OB and DL values

圖1 黃芪靶點與OP靶點匹配維恩圖注：左側表示OP相關靶點，右側表示黃芪作用靶點，重合部分表示黃芪潛在抗OP 靶點。Fig.1 Venn diagram of the targets of Astragalus and OP matching

2.2 “黃芪-活性成分-基因靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

將黃芪活性成分、靶點基因、疾病導入Cytoscape軟件，構建黃芪-活性成分-靶點基因-疾病可視化網(wǎng)絡，見圖2，節(jié)點圖形大小與連接度值呈正相關，其中M098與20個靶點相連接,可能是黃芪治療OP最重要成分，M354、M378、M392、M417、M422均與4個及以上靶點連接，見表2。

2.3 PPI及Hub蛋白確定

將OP相關靶點基因?qū)雜tring在線數(shù)據(jù)庫，設置隱藏未連接的靶點，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡，見圖3。節(jié)點表示蛋白靶點，邊表示靶點間作用關系。包含節(jié)點22個，邊140條，連接度值平均為12.7。利用Cytoscape插件中Degree算法確定度值前6為Hub蛋白，其中IL6、ESR1、MMP9等13個蛋白度值均大于平均值，見表3。

2.4 GO-BP分析和KEGG通路建立及分析

GO-BP結果分析(圖4)顯示，22個靶點基因主要參與了transcription factor activity，RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding(轉(zhuǎn)錄因子活性,RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結合，7個基因)、receptor ligand activity(受體配體活性，6個基因)、RNA polymerase II transcription factor binding(RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結合，5個基因)等多個過程；KEGG通路富集(表4)顯示在Rheumatoid arthritis(類風濕關節(jié)炎)、IL-17 signaling pathway(IL-17信號通路)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路)、Osteoclast differentiation(破骨細胞分化)過程中，均有7個靶點基因參與。

圖2 “黃芪-活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡注：圖中圓形代表疾病，六邊形代表靶點，三角形代表活性成分，菱形代表黃芪。Fig.2 "Astragalus-Ingredients-Targets-OP" Network

表2 黃芪治療OP的活性成分及潛在作用靶點Table 2 Active ingredients and key targets of Astragalus in treating OP

圖3 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡Fig.3 Protein Interaction PPI Network

表3 蛋白互作網(wǎng)拓撲結構分析結果Table 3 Protein interaction network topology analysis results

圖4 黃芪抗OP生物過程圖注：僅顯示富集結果前20的過程。Fig.4 Astragalus anti-OP biological process diagram

表4 KEGG通路富集結果Table 4 KEGG pathway enrichment results

3 討論

中醫(yī)學認為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痿”范疇，其發(fā)生主要與腎虛、脾虛、血瘀相關[14]。脾為后天之本，氣血生化之源，主肌肉，運化水谷充養(yǎng)腎精，營養(yǎng)肌肉骨骼。脾虛合并腎虛時，后天不足，運化無力，后天不能充養(yǎng)先天，加重骨骼失養(yǎng)，加速OP的發(fā)生。再有，脾虛則氣血生化無源，氣虛鼓動無力致血瘀。血瘀的病理產(chǎn)物瘀血又會加重脾虛、腎虛，進一步加重骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。因此，補脾益氣是治療骨質(zhì)疏松癥和預防骨質(zhì)疏松骨折的基礎。

本研究中篩選出20種黃芪化學成分，其中作用于骨質(zhì)疏松癥的活性成分有9種，分別是：quercetin(槲皮素)、kaempferol(山萘酚)、isorhamnetin(異鼠李素)、Jaranol、3,9-di-O-methylnissolin、formononetin、Calycosin、(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol、7-O-methylisomucronulato。槲皮素能夠與20個骨質(zhì)疏松靶點相結合，多通路發(fā)揮抗OP效用。顧藝婧等[15]研究表明，槲皮素能夠抑制骨細胞衰老，提高骨小梁數(shù)量，從而達到治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果；另外槲皮素還能夠激活ERK磷酸化，從而使骨髓間質(zhì)干細胞增殖過程的到促進，發(fā)揮成骨作用[16]。山萘酚具有雌激素樣活性，能夠促進成骨細胞增殖活化過程。研究[17]也證實山萘酚能夠體外提高成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性，促進大鼠成骨細胞的增殖與分化過程。在促進大鼠成骨分化，提高骨密度，改善骨微結構的治療效果上要好于槲皮素[18]。異鼠李素也是黃芪抗OP重要成分之一，作用途徑是增加骨礦密度及體積，提高骨小梁厚度及數(shù)量，降低骨小梁間距，具有防止去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用[19]。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡顯示，靶蛋白之間是通過多途徑、相互調(diào)節(jié)、共同作用的過程，而非單獨發(fā)揮作用的作用機制。Hub蛋白是指高連通蛋白，是藥物發(fā)揮生物學效應的關鍵靶點。IL6是一種多效應性細胞因子，能夠起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。通過對活動期類風濕關節(jié)炎患者的研究[20]顯示，RA造成的骨質(zhì)流失，與循環(huán)中細胞因子水平升高有關，內(nèi)源性細胞因子(RANKL和IL6)可直接抑制成骨細胞增殖和分化，另外還能夠刺激破骨細胞形成。ESR1為雌激素受體α的編碼基因，是骨質(zhì)疏松雌激素通路上的重要靶點基因。ESR1可調(diào)節(jié)骨代謝和峰值的獲取，抑制骨丟失，在骨生長和骨量維持中發(fā)揮重要作用。雌激素受體與雌激素結合后，能夠激活破骨細胞下游信號通路Fas/ FasL，從而誘導破骨細胞發(fā)生凋亡[21]。另外ESR1基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松癥也有關[22]，原因是染色體6P25.1區(qū)上的某些基因型突變可能直接與骨形成有關；MMP9基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，動物實驗[23]顯示MMP9與骨量相關。MMP9基因缺失，可提高骨小梁連接密度，而MMP9高表達則呈現(xiàn)破骨細胞吸收能力增強，骨質(zhì)疏松的表現(xiàn)。

GO-BP結果顯示黃芪抗骨質(zhì)疏松成分作用的靶點蛋白功能主要集中在RNA轉(zhuǎn)錄、配受體活性方面。異常的轉(zhuǎn)錄翻譯將導致下游編碼蛋白的變異及功能異常，使細胞內(nèi)外配受體結合障礙，不能發(fā)揮正常的生物功能。KEGG富集分析結果顯示，破骨細胞分化、類風濕關節(jié)炎、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路和雌激素信號通路可能是主要作用通路。基于此，筆者認為黃芪抗骨質(zhì)疏松的主要作用機制就是以上過程。在類風濕關節(jié)炎通路中，AP1可以通過RANKL/RANK通路影響破骨細胞分化過程,該通路是骨質(zhì)疏松的經(jīng)典過程，成骨細胞來源的RANKL可以與破骨細胞RANK結合，從而誘導破骨細胞的分化與成熟[24]。在破骨細胞分化通路中，黃芪可能是通過直接和間接兩個路徑。直接路徑中活性成分直接作用于特異性破骨細胞因子c-FOS,抑制破骨細胞分化[25]；間接路徑中作用于核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄子PPARγ,PPARγ[26]可促進骨髓間充質(zhì)細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)換，從而導致骨髓脂質(zhì)代謝紊亂，使間充質(zhì)細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化減少，破骨細胞分化成熟增多，兩者平衡被打破，發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此筆者認為，黃芪在破骨細胞通路上可能是通過抑制PPARγ表達和增強c-FOS表達實現(xiàn)的。IL-17信號通路中主要作用于AP-1、IL6、IL1β、MMP3、MMP9等因子，有雌激素參與誘導IL-17分化可能是骨質(zhì)疏松的新機制，雌激素能夠逆轉(zhuǎn)IL-17直接刺激成、破骨細胞的作用[27]，表現(xiàn)出破骨細胞成熟分化被抑制，受抑制的成骨細胞礦化被解除。Dixit等[28]的研究也證實，抗IL17抗體能夠增強骨骼再生，提高損傷部位成骨標志物表達水平，降低氧化應激反應，在骨質(zhì)疏松性骨折中能促進骨愈合及再生的潛力。AGE-RAGE信號通路中黃芪作用于IL1、IL6、MMP2、STAT1,3、AP1等因子，該過程可能是通過AP1參與的MAPK信號通路間接調(diào)節(jié)骨細胞發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)在一定的環(huán)境下可促進骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的磷酸化，提高MAPK的蛋白表達，加速EPCs向成骨細胞分化，該成骨細胞的分化過程主要與MAPK通路中的p38和JNK相關[29]。MAPK通路還可參與消化系統(tǒng)的生物過程，具有保護胃粘膜上皮細胞的作用。另外，通路富集結果中Toll樣受體信號通路、炎癥性腸病通路，PI3K-Akt信號通路等與消化系統(tǒng)、脾臟相關通路的出現(xiàn)，可能是黃芪從脾治療骨質(zhì)疏松癥的重要證據(jù)。

綜上所述，通過網(wǎng)絡藥理學分析，黃芪抗骨質(zhì)疏松的分子機制是多成分、多分子、多路徑的共同作用、相互作用的復雜過程；不僅直接參與骨代謝，還間接通過消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等影響骨微環(huán)境，調(diào)節(jié)骨代謝，這也體現(xiàn)了中醫(yī)學整體觀念的理念。另外，大量文獻報道結果與本研究方法中的成分、靶點、通路相一致，也證實了本研究方法的可靠性。但是，本次研究結果中也顯示出很多未知的分子通路及作用機制，需要深入研究，這也為進一步從補脾方向研究骨質(zhì)疏松癥提供了一定的參考。