夏維 胡玲 劉東 胡紅兵

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是發(fā)生于哺乳動物mRNA上最為常見的修飾[1]。m6A高通量測序結(jié)果證實超過7 000個人類基因含有m6A，且每2 000個核苷酸中有一個m6A。m6A修飾主要發(fā)生于mRNA高度保守的共識序列：RRACH(R = G or A；H = A，C or U)[2]。研究表明，m6A影響mRNA的剪接、運輸、翻譯和降解，參與脂肪生成、發(fā)育、致癌、干細胞再生以及其他生命進程[2]。

AlkB同源蛋白5(AlkB homologue 5，ALKBH5)是目前發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶之一，在m6A動態(tài)調(diào)控過程中起到重要作用[3]。ALKBH5屬于AlkB家族蛋白成員，具有保守的鐵連接區(qū)域和α-酮戊二酸作用區(qū)域[4]。研究證實ALKBH5與小鼠的生殖密切相關(guān)，ALKBH5敲除小鼠mRNA的m6A水平顯著上調(diào)，并且小鼠睪丸萎縮，精子數(shù)目和活動力的下降[5]，但具體發(fā)生機制尚不明確。

富含半胱氨酸分泌蛋白2(CRISP2，Cysteine-rich secretory proteins 2)主要存在于哺乳動物雄性生殖系統(tǒng)，且與生殖的不同階段相關(guān)[6]。CRISP2敲除的小鼠精子功能缺陷，導致生殖障礙[7]。β-防御素1(DEFB1，β-defensin 1)廣泛分布于機體內(nèi)，具有抗微生物的活性，抑制DEFB1功能會降低正常精子的活力和殺菌活性[8]。為了探究m6A升高引起的男性弱精癥的發(fā)病機制，本研究通過敲除和過表達精原細胞(GC-1)的m6A去甲基化酶ALKBH5，檢測m6A和精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1的表達，從而明確m6A去甲基化酶ALKBH5對小鼠精原細胞(GC-1)功能的影響。

材料與方法

1.材料:研究所需的主要試劑和儀器包括DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、0.25% 胰蛋白酶(美國Thermo公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)(美國Gibco公司)、Lipofectamine 3000 (美國Invitrogen公司)、iTaqTMUniversal Supermixes (美國BioRad公司)、ALKBH5抗體(中國Proteintech公司)、GAPDH抗體(中國Proteintech公司)、TRIzol (美國Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)、核酸酶S1(中國Takara公司)、堿性磷酸酶(中國Takara公司)、磷酸二酯酶(中國Sigma-Aldrich公司)、標準品(rA，rU，rC，rG，dA，T，dC，dG，m6A)(中國Sigma-Aldrich公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、低溫離心機(美國Beckman公司)、LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)、Hisep C18-T色譜柱 (150 mm×2.1 mm 5 μm，中國韋泰公司)、AB 3200 QTRAP 質(zhì)譜儀(美國Life Technologie公司)。

2.細胞培養(yǎng):由本實驗室凍存復蘇而得的人胚腎細胞HEK293T和小鼠精原細胞(GC-1)于含有10% 胎牛血清和1%雙抗DMEM的培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2進行培養(yǎng)，當細胞生長狀態(tài)良好并且融合度達到約80% 時，進行細胞傳代或繼續(xù)下列實驗。

3.ALKBH5敲除與過表達：利用Lipofectamine 3000將ALKBH5敲除質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48 h后收集含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清液，濃縮病毒液，用病毒液感染小鼠精原細胞(GC-1)，72 h 后加入2 μg/mL 的嘌呤霉素篩選，將篩選出的細胞擴大培養(yǎng)并收樣，設(shè)置敲除組sh-ALKBH5和對照組sh-CTL；利用Lipofectamine 3000 將質(zhì)粒pcDNA3.1-ALKBH5與空載pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至小鼠精原細胞(GC-1)，48 h后收集轉(zhuǎn)染的細胞，設(shè)置過表達組oe-ALKBH5和對照組oe-CTL。

4.RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄：TRIzol法提取ALKBH5敲除和過表達細胞RNA，方法參照試劑說明書，40 μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀，用NanoDrop檢測RNA的濃度與純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，方法參照試劑盒說明書。

5.LC-MS/MS檢測細胞m6A水平：利用核酸酶S1、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶酶解精子RNA，采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測細胞m6A水平。檢測方式為多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式，監(jiān)測離子對(母離子→子離子)分別為：m6A(282.2 →150.1)，rA(268.4 → 136.2),rU(245.4 → 113.1),rC(244.4 → 112.2)，rG(284.5 → 152.2)，dA(252.4 → 136.2)，T(243.3 → 127.2)，dC(228.4 → 112.2)，dG(268.4 → 152.4)。

6.qPCR檢測精子功能相關(guān)基因的表達水平：qPCR儀檢測精子功能相關(guān)基因(CRISP2和DEFB1)表達水平，利用β-肌動蛋白(β-ACTIN)基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)基因作為內(nèi)參基因進行標化，引物如下(5′→3′)：CRISP2上游引物5′-CGGACATTACACTCAG-3′，下游引物5′-TTGTTACCCATAGGAC-3′，DEFB1上游引物5′-CTTTCTCCTGGTGATG-3′，下游引物5′-GTTCCCTGTAGTTTGG-3′，GAPDH上游引物5′-CAGCAACTCCCACTCTTCCAC-3′，下游引物5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3′，β-ACTIN上游引物5′-GTACGACCAGAGGCATACA-3′，下游引物5′-AGCACCCTGTGCTGCTCA-3′。

7.蛋白提取與Western 印跡：收集ALKBH5敲除和過表達細胞(sh-ALKBH5、sh-CTL、oe-ALKBH5、oe-CTL)，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min。離心收集上清液，加入上樣緩沖液煮沸，得到細胞總蛋白樣品。采用10% SDS-PAGE 分離膠電泳分離細胞總蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h后，于4 ℃一抗孵育過夜，TBST 洗脫15 min三次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗脫15 min三次，顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。

結(jié)果

1.GC-1細胞的ALKBH5敲除及過表達：通過Western 印跡檢測ALKBH5敲除和過表達細胞(sh-ALKBH5、sh-CTL、oe-ALKBH5、oe-CTL)的ALKBH5蛋白表達(見圖1)，sh-ALKBH5組細胞ALKBH5表達顯著低于對照組(sh-CTL)，oe-ALKBH5組細胞ALKBH5表達顯著高于對照組(oe-CTL)，表明在GC-1細胞中成功敲除和過表達ALKBH5。

2.ALKBH5敲除及過表達細胞m6A含量：LC-MS/MS檢測精子RNA的m6A水平，結(jié)果表明敲除組sh-ALKBH5的 m6A含量(0.337%±0.011%)明顯高于對照組sh-CTL的m6A 含量(0.293%±0.006%)，P=0.004(見圖2)；過表達組oe-ALKBH5細胞m6A含量(0.214%±0.011%)明顯低于對照組oe-CTL的m6A 含量(0.256%±0.012%)，P=0.028。

圖2 ALKBH5敲除及過表達細胞m6A含量

3.ALKBH5敲除及過表達細胞中精子功能相關(guān)基因表達：熒光定量PCR檢測ALKBH5敲除及過表達細胞中精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1的表達水平，結(jié)果表明敲除ALKBH5，精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1表達水平下降；過表達ALKBH5，CRISP2和DEFB1表達升高(圖3)。

圖3 ALKBH5敲除及過表達細胞中精子功能相關(guān)基因表達

討論

m6A是近年來研究比較熱門的RNA甲基化修飾，m6A影響mRNA的穩(wěn)定性和功能，可通過參與mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運、加工等過程來影響基因的表達[9]。ALKBH5是具有RNA去甲基化活性的AlkB家族蛋白，在人類細胞系中敲除ALKBH5，不僅會導致總RNA的m6A含量升高，還會促進這些RNA從細胞核向細胞質(zhì)的運輸。此外，ALKBH5還影響RNA的初期合成和剪接效率[9]。本研究敲除和過表達精原細胞(GC-1)的m6A去甲基化酶ALKBH5，敲除ALKBH5導致m6A水平升高，過表達ALKBH5導致m6A水平降低。由此可見，ALKBH5作為m6A去甲基化酶，在調(diào)控GC-1細胞m6A過程中起到重要作用。隨后本實驗檢測了敲減和過表達ALKBH5的精原細胞精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)ALKBH5抑制CRISP2和DEFB1基因的表達，其可能的機制是ALKBH5促進m6A的去甲基化，從而影響CRISP2和DEFB1基因的穩(wěn)定表達。

CRISP2是不育相關(guān)基因中的潛在候選基因，在弱精子癥病人精子中，CRISP2蛋白水平降低，且CRISP2表達的降低與低精子活動度和不正常的精子形態(tài)具有相關(guān)性[7]。CRISP2敲除小鼠的精子受精能力和Ca2+調(diào)控缺陷導致了小鼠的生殖缺陷[7]。DEFB1是首個被證實的β-defensin 家族成員，在不育男性精子中，DEFB1的含量是明顯低于正常精子的，且與精子活動度和抗菌活性降低密切相關(guān)。DEFB1與趨化因子受體6(chemokine receptor type 6，CCR6)相互作用，促發(fā)對精子運動具有重要作用的Ca2+動員，因此在活力異常的男性不育患者中，DEFB1可能具有診斷和治療潛能[8]。本研究在細胞水平驗證了ALKBH5調(diào)控的m6A改變會引起CRISP2和DEFB1表達改變，而CRISP2和DEFB1對精子的功能具有重要影響，由此可以推斷，m6A去甲基化酶ALKBH5通過影響CRISP2和DEFB1的表達，而影響精子的功能，這可能也是弱精癥精子活動度降低的原因之一。

綜上所述，本研究通過在小鼠精原細胞GC-1中干擾和過表達ALKBH5，探究ALKBH5調(diào)控的m6A修飾對精子功能相關(guān)基因的影響，為弱精子癥發(fā)病機制的研究提供依據(jù)，對男性不育的研究具有一定的意義。