易清清 孟擁軍 常 慶 梁冬雨 章雨婷 姜國(guó)偉

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室1，上海 201800)(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院藥劑科2，上海 201800)(上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院3，上海 201318)

工業(yè)生產(chǎn)大豆異黃酮的過程會(huì)產(chǎn)生很多廢水，這些廢水中含有大豆皂苷組分[2]。大豆皂苷是一種生物活性物質(zhì)，近年來，國(guó)內(nèi)外許多專家、學(xué)者對(duì)大豆皂苷的生物學(xué)、生理學(xué)和藥理學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)大豆皂苷對(duì)人體不僅無毒害作用，而且具有許多有益的生理功能。大豆皂苷具有多種生理活性和良好藥理作用，具有抗癌、調(diào)節(jié)免疫功能、降低血清中膽固醇含量、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、護(hù)肝、減肥等多重生理功效[1]。結(jié)構(gòu)不同的大豆皂苷生物活性不同，其中大豆皂苷B組分具有更強(qiáng)的生物活性[3，4]。大豆皂苷B組分是由低聚糖及齊墩果烯三萜縮合形成的一類化合物[5]。大豆皂苷A組分和大豆皂苷B組分具有極其相似的化學(xué)性質(zhì)，因此單獨(dú)分離和選擇性利用大豆皂苷B組分非常困難[6]。本研究探索了從工業(yè)生產(chǎn)大豆異黃酮的廢水中分離純化大豆皂苷B組分的工藝參數(shù)，從而建立大豆皂苷B組分的分離純化工藝。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ-25OB回流冷凝管；HP1100高效液相色譜儀；2X-8旋片式真空泵；WMZK-01溫度指示控制儀。

1.2 試劑

98%磷酸、碳酸氫鈉、碳酸氫鈉、均為分析純；甲醇、冰醋酸，均為色譜純；98% A組分苷元標(biāo)準(zhǔn)品；97% B組分苷元標(biāo)準(zhǔn)品；AB-8大孔樹脂；D101型大孔樹脂。

2 方法

2.1 分離純化方法

2.1.1 酸堿度對(duì)分離純化的影響

由于大豆異黃酮廢液含有一些小的多肽和黏多糖類物質(zhì)，當(dāng)酸性太強(qiáng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致廢液變性，從而使廢液變成黏稠狀，不易上柱吸附[7]。此外，大豆皂苷在堿性溶液中不穩(wěn)定，而且強(qiáng)堿性也會(huì)使一些小肽和蛋白質(zhì)變性，故pH的選擇應(yīng)為弱酸性，本研究選取pH為5、7兩個(gè)水平。

2.1.2 洗脫試劑的選擇

選用極性較弱的甲醇或乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

2.1.3 大孔樹脂的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)條件[8]，考察選用D101和AB-8大孔樹脂。皂苷的苷元部分為疏水性，能被非極性樹脂所吸附，同時(shí)皂苷分子較大，故應(yīng)選擇孔徑較大的非極性吸附樹脂。AB-8型大孔吸附樹脂是苯乙烯型弱極性共聚體，比表面積高于DM-301，最適宜水溶性、弱極性物質(zhì)的分離和純化。D101大孔吸附樹脂是一種具有多孔海綿狀結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，依靠樹脂骨架和被吸附的分子(吸附質(zhì))之間的范德華力，通過樹脂巨大的比表面積進(jìn)行物理吸附，從而從水溶液中分離純化水溶性較差的有機(jī)大分子。

以樹脂選擇、 上柱pH、洗脫劑作為考察因素，各取2個(gè)水平，以測(cè)定提取產(chǎn)物的總質(zhì)量和大豆總皂苷B組分的含量為指標(biāo)，選用析因設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表1)。收集80%洗脫劑的洗脫物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，通過HPLC檢測(cè)計(jì)算大豆皂苷B組分的含量。

表1 不同考察因素的分離純化方法

2.2 分離純化步驟

將直徑為4.5 cm，高度為80 cm的玻璃柱固定，下面放入紗布包的玻璃珠。然后將大孔樹脂導(dǎo)入含水燒杯中，攪拌均勻，緩慢倒入玻璃柱中。加入適量大孔樹脂，一般以加到玻璃柱的2/3左右為宜。每根玻璃柱約裝入500 g大孔樹脂。

調(diào)廢水pH：根據(jù)表1，用3%～5%左右的HCl和NaOH溶液來調(diào)節(jié)廢液至所需的pH值。

廢液上柱：2 500 mL(約2.5倍柱體積)廢液沿柱壁分批加入相應(yīng)的大孔樹脂柱，廢液流速約為20 mL/min。分批上柱過程中小心廢水留空，避免色譜柱產(chǎn)生氣泡。

解吸附：根據(jù)表1，先用去離子水4 000 mL(約4倍柱體積)洗脫，至洗脫液為無色；再用體積分?jǐn)?shù)為10%相應(yīng)溶劑2 500 mL(約2.5倍柱體積)洗脫；最后用體積分?jǐn)?shù)為80%的相應(yīng)溶劑1 000 mL(約1倍柱體積)洗脫，收集中間部分約500 mL 的洗脫液(前100 mL和后400 mL舍棄)。

蒸干：利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分批將500 mL洗脫液濃縮蒸干，蒸發(fā)過程中避免暴沸。收集圓底燒瓶中的固體產(chǎn)物，于研缽中研磨至細(xì)粉狀，稱重，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 結(jié)晶純化

考察因素[9]：pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比。

pH選擇：根據(jù)大豆皂苷的穩(wěn)定性，選取pH為5、7。

乙醇體積分?jǐn)?shù)：B組分大豆皂苷不溶于冷的低濃度乙醇溶液，而A組分大豆皂苷和其他的一些雜質(zhì)能夠溶解，故選取純水、體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇、體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇作為考察對(duì)象。

料液比：每2 g樣品分別加入12 mL、18 mL、24 mL相應(yīng)溶劑進(jìn)行結(jié)晶。

結(jié)晶實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以乙醇濃度、溶劑pH、料液比作為考察因素，各取3個(gè)水平，以測(cè)定純化產(chǎn)物的總質(zhì)量和大豆總皂苷B組分的含量為指標(biāo)，選用正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表2)。

表2 不同考察因素的純化方法

根據(jù)表2，用1%的HCl和NaOH溶液，調(diào)節(jié)結(jié)晶溶劑的pH至所需值。選用2.2中純化的產(chǎn)物作為結(jié)晶的初始樣品。分別取2 g初始樣品加入相應(yīng)的溶劑中，各組大豆皂苷溶液放入700 W超聲波儀中溶解40 min，隨后放入80 ℃水浴鍋中溶解2 min，靜置冷卻至室溫，通過布氏漏斗抽真空過濾，收集濾紙上的不溶物，最后真空抽濾機(jī)蒸干，收集蒸干后的固體，研磨成細(xì)粉。采用HPLC對(duì)大豆皂苷B組分的含量進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 沸水蒸干后產(chǎn)物的HPLC圖譜

A組分大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)品圖譜如圖1a；B組分大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)品圖譜如圖1b；廢水蒸干后產(chǎn)物的HPLC圖譜如圖1c。由圖1可知，A組分大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為8.684 min，峰面積為407.481 40；B組分大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為21.740 min，峰面積為552.607 79。沸水蒸干之后所得粉末取樣量為41.53 mg，其中A組分皂苷的出峰時(shí)間為8.506 min，計(jì)算得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.62%；B組分皂苷的出峰時(shí)間約為21.3 min，計(jì)算得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.67%。

圖1 廢水蒸干后產(chǎn)物的HPLC圖譜

3.2 分離純化產(chǎn)物的HPLC圖譜

圖2為1.1～1.8分離純化方法所得產(chǎn)物的HPLC圖譜。表3為1.1～1.8分離純化方法所得產(chǎn)物中大豆皂苷A組分和大豆皂苷B組分的含量。故綜合考慮，選擇的最佳大孔樹脂分離純化工藝為1.3，即調(diào)節(jié)廢水pH=5，選取D101樹脂進(jìn)行吸附，最后用乙醇解脫吸附。

圖2 分離純化產(chǎn)物的HPLC圖譜

表3 不同分離純化方法中大豆皂苷B組分的含量

3.3 結(jié)晶純化產(chǎn)物的HPLC圖譜

圖3為2.1～2.6結(jié)晶純化方法所得產(chǎn)物的HPLC圖譜。表4為2.1～2.6結(jié)晶純化方法所得產(chǎn)物中大豆皂苷A和大豆皂苷B的含量。從結(jié)晶實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，結(jié)晶純化工藝2.3為最佳的工藝路線，即2 g分離純化產(chǎn)物加入到24 mL，pH5的20%乙醇中進(jìn)行結(jié)晶純化。

圖3 結(jié)晶純化產(chǎn)物的HPLC圖譜

表4 不同結(jié)晶純化方法中大豆皂苷B組分的含量

采用大豆皂苷的分離純化技術(shù)及結(jié)構(gòu)分析測(cè)定方法，可以得到較多較純的大豆皂苷，并應(yīng)用于食品、化妝品和藥品等領(lǐng)域[10，11]。大豆皂苷可阻止由脂質(zhì)過氧化引起的皮膚疾病， 減少皮膚病的發(fā)生。日本學(xué)者已經(jīng)研究出含有大豆皂苷的化妝品，其實(shí)用效果已經(jīng)得到證實(shí)[12]。大豆皂苷具有發(fā)泡性和乳化性，可在食品中作為添加劑。此外，從工業(yè)廢水中分離純化大豆皂苷還具有較大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)保價(jià)值。因此，對(duì)大豆皂苷B組分從工業(yè)廢水中分離純化的工藝進(jìn)行深入研究，通過改進(jìn)分離純化和結(jié)晶純化工藝以獲得高質(zhì)量高純度的產(chǎn)物，具有重大的研究意義。

4 結(jié)論

研究了分離純化工藝參數(shù)對(duì)從生產(chǎn)大豆異黃酮的廢水中分離純化大豆皂苷B組分的影響，并在此基礎(chǔ)上，探索建立了一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)且可適用于以廢水為原料生產(chǎn)大豆皂苷B組分的制備工藝。建立了大豆皂苷B組分的分離純化方法，采用大孔樹脂純化大豆皂苷 B 組分，選用D101型樹脂為層析柱的填充料，以水-乙醇體系進(jìn)行洗脫，得到純度為18.96%的大豆皂苷 B 組分，此時(shí)主要雜質(zhì)為大豆皂苷 A 組分。建立了大豆皂苷 B 的結(jié)晶純化方法，一些未知雜質(zhì)和大豆皂苷 A 組分較易溶解于低濃度乙醇，通過利用低濃度的乙醇進(jìn)行結(jié)晶以獲得純度更高的大豆皂苷 B 組分，純度可提高至35%。

本研究建立的大豆皂苷B組分的分離純化方法，雖然能夠提高大豆皂苷B組分的含量，但與預(yù)期的純度還有很大差距，還需要進(jìn)一步的研究探索。