周亞妮，劉 丹

(1. 商洛學(xué)院健康管理學(xué)院， 商洛726000；2. 西安市第五人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，西安710061)

在2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中，炎性介質(zhì)補(bǔ)體5a (C5a)及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)與炎性反應(yīng)程度存在線性相關(guān)，抑制C5a 可以降低IL-6、TNF-α 的表達(dá)，說(shuō)明C5a 在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[1-5]。抗C 5a 受體(C5aR)抗體屬于C5a 拮抗劑，可抑制炎性介質(zhì)C5a的活性，減輕炎性反應(yīng)。研究資料顯示，施用抗C5aR抗體，可以提高TNBS誘導(dǎo)克羅恩模型大鼠的生存率，減輕結(jié)腸水腫，降低結(jié)腸和血清中一些炎性因子的水平，增加動(dòng)物進(jìn)食量和體質(zhì)量[6]。

抗C5aR 抗體目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，單獨(dú)使用對(duì)免疫系統(tǒng)有顯著的抑制作用，并且對(duì)腸黏膜有一定刺激性[7-9]。大蒜屬于一種日常食材，研究表明，在腸道感染中大蒜素不僅具有重要的抗菌效果，而且對(duì)腸道黏膜有一定的修復(fù)作用[10]。為了進(jìn)一步探索對(duì)炎性腸病(IBD)的有效治療方案，作者以TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠為研究對(duì)象，以C5a、IL-6 在IBD 炎性活動(dòng)期表達(dá)增高為線索，開(kāi)展“抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療IBD”實(shí)驗(yàn)，分別使用抗C5aR 抗體、大蒜素和抗C5aR抗體聯(lián)合大蒜素三種不同藥物方案對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃治療，為臨床IBD 的治療和大蒜素的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠100 只，6～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(陜)K2018-0155]提供。動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[SYXK(陜)K2017-0210]，實(shí)驗(yàn)計(jì)劃通過(guò)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑和儀器

抗C5aR 抗體購(gòu)自上海吉爾生物化學(xué)有限公司（批號(hào)：720120617F）；大蒜素注射液購(gòu)自山東辰欣藥業(yè)有限公司（批號(hào)：M15342Mm）；IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒均購(gòu)自北京城林生物有限公司；紫外分光光度儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司（型號(hào)：1560VICTOR3）；酶標(biāo)儀購(gòu)自北京伯輝生物科技有限公司（型號(hào)：Model 680）；灌胃器購(gòu)自山東科維器械有限公司（型號(hào)：大鼠灌胃器16#）;其他常規(guī)試劑及手術(shù)器械均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 動(dòng)物造模及分組處理

80 只大鼠以TNBS 誘導(dǎo)法建立IBD 模型[11]。建模后第1日將80只IBD大鼠隨機(jī)分成4組，每組20 只。（1）模型對(duì)照組：每日以0.9%生理鹽水2 mL 灌胃。（2）抗C5aR 抗體治療組：每日以10 mg/kg 抗C5aR 抗體灌胃。（3）大蒜素治療組：每日以10 mg/kg 大蒜素注射液灌胃。（4）抗C5aR抗體聯(lián)合大蒜素治療組：每日以抗C5aR 抗體和大蒜素混懸液同劑量灌胃。另20 只大鼠為正常對(duì)照組，未進(jìn)行任何藥物灌胃，正常飼養(yǎng)。

每日灌胃1次，固定每日15∶00 進(jìn)行操作，連續(xù)灌胃2 周，每次灌胃完畢后常規(guī)飼養(yǎng)，每日觀察大鼠活動(dòng)、大便性狀和死亡情況等，如出現(xiàn)死亡即刻進(jìn)行解剖。分別于灌胃后2 d、3 d、7 d 和14 d，用配制的麻醉劑（0.4 mL/只）經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，進(jìn)行固定后，消毒，經(jīng)尾靜脈采集血液5～7 mL，室溫環(huán)境靜置1 h 后，離心5 min，取上清液分裝，做標(biāo)記，保存于-20 ℃低溫冰箱，待測(cè)。

1.4 麻醉劑的配制[12]

將氯胺酮、速眠新和生理鹽水按體積比2∶1.5∶3.5 配成混合溶液，作為注射用麻醉劑，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 大鼠體質(zhì)量變化和生存率統(tǒng)計(jì)

各組大鼠于藥物灌胃前和灌胃干預(yù)后14 d（實(shí)驗(yàn)結(jié)束）進(jìn)行體質(zhì)量和大鼠死亡數(shù)量的記錄。

1.6 大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平檢測(cè)

從-20 ℃低溫冰箱內(nèi)取出待測(cè)標(biāo)本，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行IL-6、TNF-α 檢測(cè)。

1.7 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

藥物灌胃后14 d，用頸椎脫臼法處死所有大鼠，剖腹并游離全結(jié)腸，對(duì)其進(jìn)行清洗處理，觀察腸道炎性損傷情況；取病變明顯處結(jié)腸組織一小段，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，HE 染色，制成切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。參照有關(guān)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用±s表示，正態(tài)分布資料的組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存率及體質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)期間，模型對(duì)照組大鼠死亡4 只，抗C5aR抗體治療組和大蒜素治療組大鼠死亡例數(shù)均為2 只，抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組和正常對(duì)照組大鼠無(wú)死亡（表1）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型對(duì)照組和大蒜素治療組大鼠的體質(zhì)量與治療前幾乎無(wú)明顯變化，抗C5aR抗體組較造模前體質(zhì)量有所增長(zhǎng)，而抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度較大，正常對(duì)照組體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)（表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型對(duì)照組、抗C5aR 抗體治療組和大蒜素治療組的大鼠體質(zhì)量均明顯低于抗C5aR抗體聯(lián)合大蒜素治療組（均P＜0.05）。

表1 大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化Table 1 Changes of body weight of rats before and after experiment(±s)

表1 大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化Table 1 Changes of body weight of rats before and after experiment(±s)

注：#實(shí)驗(yàn)過(guò)程中這3 組大鼠均有死亡。與抗C5aR 抗體+ 大蒜素治療組比較，*P＜0.05。

組 別 用藥前體質(zhì)量/g 實(shí)驗(yàn)結(jié)束體質(zhì)量/g模型對(duì)照組(n=16)#抗C5aR 抗體治療組(n=18)#大蒜素治療組(n=18)#抗C5aR 抗體+大蒜素治療組(n=20)218±15.69218±15.73218±15.54218±15.34218±15.52正常對(duì)照組(n=20)217±16.35*222±13.65*218±19.14*230±17.58232±21.47

2.2 血清中IL-6 和TNF-α 分泌水平

由表2、表3 可以看出，幾乎每個(gè)時(shí)間段的模型對(duì)照組血清中IL-6 和TNF-α 水平都為最高值，抗C5aR 抗體治療組和大蒜素治療組IL-6 水平居中，抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組最低，與模型對(duì)照組、抗C5aR 抗體治療組和大蒜素治療組相比的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 大鼠結(jié)腸形態(tài)觀察

模型對(duì)照組（圖1A）大鼠結(jié)腸壁結(jié)構(gòu)破壞程度以及充血水腫最為明顯，表面的潰瘍也非常嚴(yán)重；抗C5aR 抗體治療組（圖1C）大鼠結(jié)腸的破壞情況較大蒜素治療組（圖1B）明顯減弱，輕度充血，有少許潰瘍；抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組（圖1D）大鼠結(jié)腸沒(méi)有明顯充血和潰瘍，與正常對(duì)照組（圖1E）較為接近，說(shuō)明抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素灌胃治療可以明顯改善TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠腸道的破壞作用。

表2 灌胃后不同時(shí)間大鼠血清IL-6 水平Table 2 Serum IL-6 in rats at different times after intragastric administration[-x ± s, ρ/(ng ·L-1)]

表3 灌胃后不同時(shí)間血清TNF-α 水平Table 3 Serum TNF-α in rats at different times after intragastric administration[-x ± s, ρ/(ng ·L-1)]

圖1 各組大鼠結(jié)腸形態(tài)觀察Figure 1 Observation of colon morphology of rats in each group

2.5 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察及評(píng)分

模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織厚度增加較其余三組明顯（圖2A）?？笴5aR 抗體治療組（圖2C）的炎性反應(yīng)程度較模型對(duì)照組減輕，上皮組織修復(fù)效果較好，主要以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主。大蒜素治療組（圖2B）與抗C5aR 抗體治療組間差異不明顯?？笴5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組（圖2D）結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，炎性明顯減輕，可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及再生的上皮組織。各組大鼠病理學(xué)評(píng)分，模型對(duì)照組最高，抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組最低，明顯低于模型對(duì)照組、抗C5aR 抗體治療組和大蒜素治療組（均P＜0.05，表4）。

圖2 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察(HE,×100)Figure 2 Histopathological observation on colon in rats (HE,×100)

表4 大鼠結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分Table 4 Pathological score of colon in rats

3 討論

IBD 是一類病因未明的慢性胃腸道非特異性炎癥。目前，對(duì)于IBD 發(fā)病機(jī)制的研究中，較多人認(rèn)為腸道內(nèi)異常的免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。抗C5aR 抗體屬于較為常見(jiàn)的免疫學(xué)制劑用藥，對(duì)于抑制IBD 的炎性反應(yīng)起到較好的治療效果，而單一用藥的副作用報(bào)道較多[14-15]。大蒜素是從大蒜中提取出來(lái)的有效成分，具有廣譜的抑菌、抗病毒以及抗真菌作用。另外，大蒜素對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)以及抑制炎性因子的分泌等也發(fā)揮著重要作用[9]。近年來(lái)，大蒜素在腸道炎性反應(yīng)中的治療作用倍受重視。

研究表明，IBD 的發(fā)生與腸道內(nèi)異常的免疫活動(dòng)密切相關(guān)，而炎性因子的分泌水平在一定程度上能夠反映病情的輕重程度[16-18]。IL-6、TNF-α屬于重要的炎性因子，其表達(dá)與炎性反應(yīng)程度有一致性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究顯示，血清中IL-6、TNF-α 作為一種炎性介質(zhì)，在一定程度上能夠反映IBD 炎性活動(dòng)程度，炎性反應(yīng)緩解，IL-6、TNF-α 的水平隨之降低[19-22]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中IL-6、TNF-α 的水平了解結(jié)腸炎炎性反應(yīng)程度，從而評(píng)估三種用藥方案的治療效果。結(jié)果表明抗C5aR抗體聯(lián)合大蒜素抑制IBD炎性反應(yīng)效果最佳。對(duì)三個(gè)治療組進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分結(jié)果分析，也發(fā)現(xiàn)抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素抑制IBD 炎性反應(yīng)的療效最佳。由結(jié)腸形態(tài)觀察和病理切片比較，聯(lián)合用藥灌胃組結(jié)腸炎性反應(yīng)最輕，可見(jiàn)再生的上皮組織，固有層有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療可以明顯改善TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎對(duì)腸道的破壞。對(duì)各組大鼠的生存率和體質(zhì)量變化分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組大鼠生存率高于其余各組；同樣，抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療組大鼠的體質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量最接近，說(shuō)明抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素治療對(duì)于恢復(fù)IBD大鼠體質(zhì)量?jī)?yōu)于大蒜素治療組或抗C5aR抗體治療組。

總之，本實(shí)驗(yàn)以TNBS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎為研究基礎(chǔ)，應(yīng)用不同藥物對(duì)大鼠灌胃干預(yù)，通過(guò)大鼠生存率比較、體質(zhì)量變化、結(jié)腸組織形態(tài)觀察、組織病理學(xué)評(píng)分以及血清中IL-6、TNF-α 分泌水平等進(jìn)行分析，得出結(jié)論：抗C5aR 抗體聯(lián)合大蒜素是治療TNBS 誘導(dǎo)性結(jié)腸炎的有效方案，其療效優(yōu)于單獨(dú)使用抗C5aR 抗體或者大蒜素，并可以提高動(dòng)物的生存率。本研究為臨床IBD 的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。