施汀蘭 張莉 黃鶴 梅小利 涂如霞 吳思瀾 蘭波 李恒華

中圖分類號 R285.5;R994.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1710-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.09

摘 要 目的：研究昆明山海棠提取物對妊娠動物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。方法：取交配成功的新西蘭雌兔，按體質量隨機區(qū)組法分為溶劑對照組、陽性對照組（環(huán)磷酰胺，20 mg/kg）和昆明山海棠提取物高、中、低劑量組（15.0、7.50、3.75 g/kg，以生藥量計），每組均至少18只。溶劑對照組和昆明山海棠提取物各劑量組雌兔在妊娠第6～18天灌胃水或相應昆明山海棠提取物藥液，5 mL/kg，每天1次;陽性對照組雌兔在妊娠第10～13天于頸部皮下注射環(huán)磷酰胺，1 mL/kg，每天1次。依據(jù)《藥物生殖毒性研究技術指導原則》相關要求，在實驗期間觀察并記錄雌兔的一般情況、體質量和攝食量，并于妊娠第28天時對其實施安樂死，解剖后觀察并記錄其主要臟器、帶胎子宮、胎盤子宮、胎盤、卵巢以及著床腺、吸收胎、死胎、活胎、黃體等相關指標，并對胎仔進行體質量、外觀形態(tài)、內(nèi)臟和骨骼發(fā)育等相關指標的檢查。結果：與溶劑對照組比較，昆明山海棠提取物各劑量組孕兔的體質量、體質量增長、攝食量、主要臟器，孕兔妊娠、生殖功能以及胚胎形成和胎仔的生長發(fā)育、外觀形態(tài)、內(nèi)臟和骨骼發(fā)育等相關指標均未見明顯異常改變（P>0.05）;陽性對照組上述指標均有顯著變化（P<0.05），表現(xiàn)出明顯的孕兔母體毒性以及胚胎和胎仔發(fā)育毒性。結論：昆明山海棠提取物在劑量為3.75～15.00 g/kg（以生藥量計）時對新西蘭兔無明顯母體毒性、胚胎或胎仔發(fā)育毒性。

關鍵詞 昆明山海棠;提取物;新西蘭兔;胚胎;胎仔;生殖毒性

Study on Toxic Effect of the Extract from Tripterygium hypoglaucum on Embryo-fetal Development of New Zealand Rabbits

SHI Tinglan，ZHANG Li，HUANG He，MEI Xiaoli，TU Ruxia，WU Silan，LAN Bo，LI Henghua（Chongqing Academy of Chinese Material Medica/Chongqing Center for Safety Evaluation of Drugs， Chongqing 400065，China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the toxic effect of the extract from Tripterygium hypoglaucum on pregnant animal and embryo-fetal development. METHODS： Successfully mated New Zealand female rabbits were randomly divided into solvent control group， positive control group （cyclophosphamide， 20 mg/kg） and T. hypoglaucum extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （15.0， 7.50， 3.75 g/kg， by the amount of crude drug） according to their body weight， with 18 rabbits in each group at least. The female rabbits in solvent control group and T. hypoglaucum extract groups were given water or the corresponding T. hypoglaucum extract solution from 6th to 18th day of pregnancy， 5 mL/kg， once a day. Positive control group was given cyclophosphamide subcutaneously into the neck from 10th to 13th day of pregnancy， 1 mL/kg， once a day. According to the related requirements of Technical Guidelines for the Study of Drug Reproductive Toxicity， the general situation， body weight， body weight increase and food intake of female rabbits were observed and recorded during the experiment， and euthanasia was carried out on 28th day of pregnancy; the relative indexes of main organs， fetal uterus， placenta uterus， placenta， ovary， implantation gland， absorption fetus， stillbirth， live fetus and corpus luteum were observed and recorded after anatomy; the relative indexes of body weight， appearance， visceral and skeletal alterations of the fetus were detected. RESULTS： Compared with solvent control group， the body weight， body weight increase， food intake， main organs， pregnancy of pregnant rabbits， as well as reproductive function， embryo formation， fetal growth and development， appearance， visceral and skeletal development indexes in T. hypoglaucum extract groups had no significant abnormal changes （P>0.05）; above indexes in the positive control group had significant changes （P<0.05）， and significant maternal toxicity and embryotoxicity were found. CONCLUSIONS： T. hypoglaucum extract 15.00-3.75 g/kg （by the amount of crude drug） have no significant maternal toxicity， embryotoxicity or fetal development toxicity to New Zealand rabbits.

KEYWORDS? ?Tripterygium hypoglaucum; Extract; New Zealand rabbits; Embryo; Fetal; Reproductive toxicity

昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum （Lévl.）Hutch.]是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名火把花、粉背雷公藤，一般以其根部入藥，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗生育、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[1-2];其在臨床多用作免疫抑制劑，用于治療類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡、血管炎、銀屑病等癥[1，3]，副作用包括引起女子月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)以及導致男子精子減少、精子活動率降低等[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，昆明山海棠根的水提物（以下簡稱“昆明山海棠提取物”）對雄性大鼠具有明顯的生殖毒性，能導致其睪丸和附睪萎縮并降低睪酮水平[5-6]。但目前有關其對妊娠動物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響鮮有報道?；诖?，本研究通過胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗對昆明山海棠提取物的生殖毒性進行考察，為該藥材的進一步研究開發(fā)及臨床安全應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BS224S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）;R2000-15型電子計重計數(shù)秤[奧豪斯儀器（常州）有限公司];YXQ-LS-50G型立式高溫高壓滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;1384A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ZSA302型體視顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）;SZ61型解剖鏡（日本Olympus公司）;CLW-1020型純水機（重慶乾崍儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

昆明山海棠提取物（重慶市中藥研究院藥化所制備;藥材產(chǎn)地為四川德昌，采用水提工藝，每15 g生藥制得1 g提取物）;注射用環(huán)磷酰胺（陽性對照，通化茂祥制藥有限公司，批號：171201，規(guī)格：0.2 g/瓶）;戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號：922L034）;氯化鈉注射液（湖北天圣康迪制藥有限公司，批號：20180816，規(guī)格：10 mL ∶ 90 mg）;茜素紅、氯化鎂（成都市科龍化工試劑廠，批號分別為20180403、2018040101）;95%乙醇、丙三醇、氫氧化鉀（重慶川東化工集團有限公司，批號分別為20181101、20180501、20180101）;水為純化水。

1.3 動物

普通級健康新西蘭兔，雌性100只，5～8月齡，體質量3.2～4.4 kg;雄性20只，5～8月齡，體質量3.3～4.3 kg。動物由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2017-0006。

2 方法

2.1 溶液配制

取昆明山海棠提取物適量，用水配制成質量濃度為3.00、1.50、0.75 g/mL（以生藥量計）的溶液，分別作為高、中、低劑量組藥液;注射用環(huán)磷酰胺用氯化鈉注射液配制成質量濃度為20 mg/mL的藥液。

2.2 動物交配與分組、給藥

雌雄兔按1 ∶ 1比例合籠交配。以雄兔在籠內(nèi)追逐雌兔、雌兔接受爬跨交配動作后確認交配成功，并將成功交配當日定為該雌兔妊娠第0日（簡稱為“GD0”，以下類推）。交配成功的雌兔根據(jù)體質量按隨機區(qū)組法分為溶劑對照組、陽性對照組和昆明山海棠提取物高、中、低劑量組（各組均至少18只）。陽性對照組雌兔于頸部皮下注射環(huán)磷酰胺（20 mg/kg，劑量和給藥途徑參照相關文獻[7]及本研究預實驗結果設置），注射體積為1 mL/kg，在GD10～GD13時給藥，每天1次;昆明山海棠提取物高、中、低劑量組雌兔灌胃昆明山海棠提取物溶液（15.00、7.50、3.75 g/kg，按生藥量計;劑量參照本課題組前期雄性大鼠體內(nèi)實驗結果設置），灌胃體積為5 mL/kg，在GD6～GD18時給藥，每天1次;溶劑對照組雌兔灌胃等容水，給藥頻次同昆明山海棠提取物各劑量組。

2.3 指標觀察及測定

依據(jù)《藥物生殖毒性研究技術指導原則》相關要求[8]，解剖觀察和記錄雌兔妊娠相關指標，并對胎仔進行相關指標檢查以及內(nèi)臟、骨骼標本制作。

2.3.1 親代雌兔 于實驗期間觀察親代雌兔的一般情況，測定并記錄其體質量、攝食量。在GD28時稱定雌兔體質量并采用吸入CO2的方式實施安樂死后，對其主要臟器（心、肝、脾、肺、腎等）進行大體解剖觀察。沿接近卵巢部位的左子宮角到陰道剪開子宮肌層，將胎仔剝離胎盤，記錄胎盤肉眼觀察結果;稱定帶胎子宮總質量以及胎盤子宮、胎盤、卵巢的質量，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、著床腺數(shù)、吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)，并計算子宮質量（子宮質量=胎盤子宮質量-胎盤質量）。計算子宮、卵巢臟體系數(shù);子宮和卵巢用10%中性福爾馬林溶液固定，必要時進行組織病理學檢查;其他組織器官，若肉眼觀察可見病變，則同法固定后進行組織病理學檢查，同時取相應的對照組親代雌兔器官行對比檢查。有吸收胎孕兔率、有死胎孕兔率、妊娠率、著床后丟失率、總丟失率等相關指標參照文獻方法[9]計算。

2.3.2 胎仔 觀察胎仔外觀，測量并記錄胎兔體質量、身長。所有存活胎兔以2.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射實施安樂死后進行內(nèi)臟和骨骼檢查。胎兔的心臟、腦、腎臟用10%氯化鎂溶液+10%中性福爾馬林溶液固定后，以顯微解剖法進行檢查;其余內(nèi)臟均以新鮮器官組織行顯微解剖法檢查;骨骼標本用95%乙醇固定和茜素紅染色后檢查。窩雌/雄仔比、四肢/尾/頭/軀干畸形率、骨骼畸形/變異率等相關指標參照文獻方法[9]計算。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。胎仔以窩別為單位統(tǒng)計。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較;計數(shù)資料以只數(shù)或率表示，采用χ2檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 親代雌兔一般情況

各組雌兔均未出現(xiàn)死亡，行為活動正常，精神狀態(tài)良好，被毛清潔、無豎毛，未見陰道出血及流產(chǎn)，也未見其他毒性癥狀出現(xiàn)。與溶劑對照組比較，陽性對照組雌兔體質量在GD18、GD21、GD25、GD28時均顯著降低（P<0.05或P<0.01），體質量增長在GD9～GD12、GD15～GD18、GD6～GD28期間均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;其余各給藥組親代雌兔體質量及體質量增長與溶劑對照組比較，各組親代雌兔的攝食量組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。昆明山海棠提取物對親代雌兔體質量、體質量增長、攝食量的影響見表1～表3（注：表中數(shù)據(jù)已剔除假孕雌兔的相關指標結果，下同）。

3.2 親代雌兔解剖檢查相關指標檢測結果

各組親代雌兔主要臟器解剖檢查均未見異常。與溶劑對照組比較，陽性對照組孕兔的終末體質量和帶胎子宮、胎盤子宮、子宮的質量均顯著降低（P<0.01）;子宮臟體系數(shù)顯著升高（P<0.01）;活胎數(shù)顯著減少，總丟失率顯著升高（P<0.05）。與溶劑對照組比較，昆明山海棠提取物各劑量組的未孕兔數(shù)、孕兔數(shù)、有吸收胎孕兔數(shù)、有死胎孕兔數(shù)、有活胎孕兔數(shù)、有吸收胎孕兔率、有死胎兔率、妊娠率等指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;孕兔終末體質量和帶胎子宮、胎盤子宮、胎盤、子宮、卵巢的質量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;孕兔子宮臟體系數(shù)、卵巢臟體系數(shù)、黃體數(shù)、著床數(shù)、著床腺數(shù)、吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、著床后丟失率、總丟失率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。昆明山海棠提取物對親代雌兔相關指標的影響見表4～表5。

3.3 胎仔生長發(fā)育指標檢測結果

與溶劑對照組比較，陽性對照組的窩胎仔總質量、窩胎仔均質量、窩胎仔均身長均顯著降低，四肢畸形率（主要表現(xiàn)為并趾、少趾、足內(nèi)翻、前肢屈曲過度、前肢活動受限）、尾畸形率（主要表現(xiàn)為短尾、卷尾）、頭畸形率（主要表現(xiàn)為腭裂、露舌、唇裂、眼球突出）和窩別外觀畸形率均顯著升高（P<0.05）;胎仔內(nèi)臟畸形率和窩別內(nèi)臟畸形率均顯著升高（P<0.05），主要表現(xiàn)為腎臟小，其余臟器檢查未見明顯異常;胎仔顱骨變異率、腰椎骨化數(shù)、骶尾椎畸形和變異率、胸骨節(jié)變異率、前肢畸形和變異率、后肢畸形率、骨骼窩變異和畸形率均顯著增加或升高，胸椎骨化數(shù)、骶尾椎骨化數(shù)、肋骨骨化數(shù)、前肢骨化數(shù)、后肢骨化數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。與溶劑對照組比較，昆明山海棠提取物各劑量組的窩胎仔總數(shù)、窩胎仔均數(shù)、窩雌仔比、窩雄仔比，四肢、尾、頭和軀干的畸形率以及窩別外觀畸形率等指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;昆明山海棠提取物高劑量組胎仔內(nèi)臟、骨骼指標以及窩變異和畸形率等指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。昆明山海棠提取物對胎仔生長發(fā)育指標的影響見表6～表9。

4 討論

根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒布的《藥物生殖毒性研究技術指導原則》，藥物生殖發(fā)育毒性非臨床研究的方法主要包括生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗和圍產(chǎn)期毒性試驗等[8]。其中，胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗的給藥時限是從胚胎著床到硬腭閉合階段，可用于評價藥物對妊娠動物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響[7-8]。

根據(jù)昆明山海棠片對雄性大鼠的生殖毒性及作用機制的前期研究結果，以5.0、10.0、20.0 g/kg（以生藥量計）等3個劑量連續(xù)90 d灌胃給藥后，與正常對照組（即溶劑對照）比較，10.0 g/kg劑量組大鼠的睪酮水平顯著降低，各劑量組大鼠睪丸和附睪出現(xiàn)萎縮，兩者的臟器質量和指數(shù)均顯著降低;停止給藥30 d后，大鼠生殖系統(tǒng)組織形態(tài)未見完全恢復[5-6]。本課題組前期通過SD大鼠Ⅰ階段生殖毒性實驗發(fā)現(xiàn)，昆明山海棠提取物按2.5、5.0、10.0 g/kg（以生藥量計）等3個劑量灌胃給藥對雄性大鼠具有明顯的生殖毒性。本研究預實驗結果顯示，對雌兔按15.0、7.5 g/kg（以生藥量計）的劑量灌胃昆明山海棠提取物后，15.0 g/kg劑量組孕兔出現(xiàn)流產(chǎn)、活胎數(shù)減少、早期吸收胎數(shù)增加等現(xiàn)象，而7.5 g/kg劑量組孕兔未見供試藥物相關的毒性反應或異常改變。根據(jù)《藥物生殖毒性研究技術指導原則》[8]及相關文獻[10-13]，結合本課題組前期研究結果，本研究將昆明山海棠提取物的高、中、低劑量分別設定為15.00、7.50、3.75 g/kg（以生藥量計）。

在本實驗條件下，新西蘭兔在GD6～GD18時灌胃高、中、低劑量昆明山海棠提取物后均未見明顯母體毒性或胚胎及胎仔發(fā)育毒性。而陽性對照組在給予環(huán)磷酰胺20 mg/kg劑量條件下，可見明顯的母體毒性和胚胎及胎仔發(fā)育毒性：母體毒性主要表現(xiàn)為孕兔體質量和體質量增長均顯著降低，帶胎子宮、胎盤子宮、子宮的質量以及子宮臟體系數(shù)均顯著降低，活胎數(shù)顯著減少，總丟失率顯著升高;胚胎毒性主要表現(xiàn)為胎仔的窩胎仔總質量、窩胎仔均質量、窩胎仔均身長均顯著降低，四肢、尾、頭畸形率以及窩別外觀畸形率均顯著升高，內(nèi)臟畸形率以及骨骼畸形和變異率均顯著升高。這與以往研究報道[14-15]的結果類似。

綜上，昆明山海棠提取物在劑量為3.75～15.00 g/kg（以生藥量計）時對新西蘭兔無明顯母體毒性、胚胎或胎仔發(fā)育毒性。本研究可為昆明山海棠提取物進一步研究開發(fā)及臨床應用提供實驗依據(jù)，下一步有必要進行該藥材提取物對妊娠/哺乳期雌鼠以及其胚胎和子代發(fā)育影響的研究，以期更全面地評價該藥材的生殖毒性。

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（收稿日期：2020-02-06 修回日期：2020-05-31）

（編輯：段思怡）