王丹 張鴻 劉嘉麗 滿(mǎn)琪 董新榮 劉德明 黃立新

摘 要：以湖南永州地區(qū)、湘西地區(qū)、張家界地區(qū)、婁底地區(qū)及四川甘孜地區(qū)這5個(gè)不同產(chǎn)地的多花黃精為試驗(yàn)材料，采用比色法對(duì)其多糖、總皂苷、總黃酮3種生物活性成分的含量進(jìn)行了測(cè)定與分析比較。結(jié)果表明：多花黃精中的生物活性成分含量因產(chǎn)地不同而存在著較大差異，多糖含量在8.09%～11.78%范圍內(nèi)變化，以?shī)涞椎貐^(qū)的最高;總皂苷含量范圍為2.73%～5.01%，以永州地區(qū)的最高;總黃酮含量范圍為0.21%～0.71%，以張家界地區(qū)及四川甘孜地區(qū)的較高?？傮w來(lái)看，不同產(chǎn)地多花黃精中多糖含量均較高，總皂苷含量居中，總黃酮含量均較低。

關(guān)鍵詞：多花黃精;產(chǎn)地;多糖;總皂苷;總黃酮

中圖分類(lèi)號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）07-0089-04

Abstract： Polygonatum cyrtonema Hua samples from Yongzhou， Xiangxi， Zhangjiajie? and? Loudi? regions of Hunan ， and Garzê region of? Sichuan were used as experimental material for the determination and comparison of? their polysaccharide， total saponins and total flavonoids contents? by colorimetric analysis method. The results showed that the contents of bioactive components in Polygonatum cyrtonema?samples varied greatly with different habitats， polysaccharide content ranged from 8.09% to 11.78%， with the highest content from Loudi region; total saponins content ranged from 2.73% to 5.01%， with the highest from Yongzhou region; total flavonoids content ranged from 0.21% to 0.71%， which was relatively higher in Zhangjiajie region of Hunan and Garzê region of Sichuan. In general， polysaccharide content of? these Polygonatum cyrtonema samples is high ， total saponins content is medium and total flavones content is low.

Key words： Polygonatum cyrtonema Hua; habitat; polysaccharide; total saponins; total flavones

黃精為百合科植物滇黃精（Polygonatum kingianum?Coll. et Hemsl）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效[1]。黃精最早見(jiàn)于晉代陶弘景的《名醫(yī)別錄》，在《本草經(jīng)集注》及《本草綱目》述及：“黃精寬中意氣，使五臟調(diào)良，肌肉充實(shí)，骨髓堅(jiān)強(qiáng)，其力增倍，多年不老”[2]，現(xiàn)為藥食兩用植物[3]?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明，黃精具有提高免疫力、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、提高記憶力等作用[4-9]。

多花黃精是南方地區(qū)的道地中藥材，但因長(zhǎng)期采挖，導(dǎo)致野生多花黃精資源稀少，不能滿(mǎn)足人們的需求。因此，人工栽培多花黃精正在興起[10]。但是，多花黃精品質(zhì)與品種、產(chǎn)地自然環(huán)境等密切相關(guān)。目前，中國(guó)藥典[1]評(píng)價(jià)黃精的品質(zhì)主要為定性評(píng)價(jià)，僅對(duì)多糖含量進(jìn)行了定量評(píng)價(jià)。國(guó)內(nèi)外研究表明，多花黃精中含有多糖、皂苷及黃酮等多種生物活性成分[11-15]。因此，客觀評(píng)價(jià)多花黃精的品質(zhì)應(yīng)該采取多指標(biāo)、同時(shí)定量的方法[16-19]。課題組采集了南方5個(gè)地區(qū)的林下仿野生種植多花黃精樣品，以多花黃精多糖、總皂苷、總黃酮含量為指標(biāo)進(jìn)行定量比較，旨在為優(yōu)選適合多花黃精生長(zhǎng)的道地產(chǎn)區(qū)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：試驗(yàn)所用黃精為人工栽培三年生多花黃精塊莖，采集時(shí)間為11月下旬，采集地點(diǎn)分別為湖南永州地區(qū)（A）、湘西地區(qū)（B）、張家界地區(qū)（C）、婁底地區(qū)（D）及四川甘孜地區(qū)（E）5個(gè)多花黃精主產(chǎn)區(qū)，每個(gè)區(qū)域采集樣品3份。

對(duì)照樣品：人參皂苷（B2p0234，安徽省合肥博美生物科技有限責(zé)任公司），菝葜皂苷對(duì)照品（批號(hào)：ST191029-010，樂(lè)美天醫(yī)藥/德思特生物），薯蕷皂苷元對(duì)照品（批號(hào)：1539-200001，中國(guó)藥品生物制品檢定所），蘆?。▏?guó)家食品藥品檢定研究院）。

主要試劑：葡萄糖（AR）、香草醛、蒽酮、濃硫酸、無(wú)水乙醇、甲醇、高氯酸、冰醋酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

供試儀器：UV-9600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞麗分析儀器公司），AX-200型萬(wàn)分之一分析天平（日本Shimadzu Philipines公司），DYF-200萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），DZKW-D-2恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器），SB25-12DT超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將同一個(gè)產(chǎn)地的3份新鮮多花黃精樣品洗凈后切成約1 mm薄片并充分混勻，用烘箱在60℃下干燥至水分含量低于5%。用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，用封口塑料袋收集粉末，4℃保存于冰箱備用。

1.2.2 多糖含量分析 （1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱(chēng)取一水葡萄糖32.4 mg，置100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到0.294 5 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液。移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL于10 mL具塞比色管中，分別加水至2.0 mL，搖勻。在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻。置沸水浴中保溫10 min，取出后于冰水浴中冷卻10 min。以水為空白對(duì)照，在582 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測(cè)定。參照中國(guó)藥典（2015版）黃精多糖含量測(cè)定方法制備樣品溶液[1]。按上述方法顯色并測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度，按公式（1）計(jì)算多花黃精中多糖含量。

其中，Y為多糖或總皂苷或總黃酮含量，C為多糖或總皂苷或總黃酮濃度（mg/L）;V為多糖或總皂苷或總黃酮溶液體積（L）;m為多花黃精質(zhì)量（g）。

1.2.3 總皂苷含量分析 （1）對(duì)照樣品選擇。參考文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行。具體操作：將0.3 mL的黃精提取物的甲醇溶液、人參皂苷（1.07 mg/mL）溶液、菝葜皂苷（0.65 mg/mL）溶液、薯蕷皂苷元（0.27 mg/mL）溶液分別置于4支10 mL具塞比色管中，于80℃恒溫水浴鍋中揮盡溶劑。加入0.2 mL 新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液，然后在冰水浴下加入0.8 mL高氯酸，搖勻，放入60℃恒溫水浴鍋中加熱15 min。取出后置冰水浴中冷卻2 min，加入冰醋酸至5 mL。搖勻，靜置5 min。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在300～700 nm下，測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)。（2）薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱(chēng)取薯蕷皂苷元2.7 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含薯蕷皂苷元0.27 mg/mL的儲(chǔ)備溶液。移取薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置于10 mL具塞比色管中，顯色。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在452 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）樣品中皂苷含量的測(cè)定。稱(chēng)取干燥后的黃精粉末0.25 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL濃度為80%的乙醇溶液，加熱回流提取1 h，稍冷后趁熱過(guò)濾;殘?jiān)盀V紙裝回圓底燒瓶中再提取一次，過(guò)濾。收集濾液，減壓濃縮至干，甲醇超聲溶解，定容至25 mL，得到樣品溶液。移取0.20 mL樣品溶液于具塞比色管中，揮盡溶劑后按照上述方法顯色并測(cè)定吸光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總皂苷濃度，參照公式（1）計(jì)算多花黃精中總皂苷含量。

1.2.4 總黃酮含量分析 （1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。稱(chēng)取蘆丁3.5 mg于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液溶解，再用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.07 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。參考文獻(xiàn)[19]方法。移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中。加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min;再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min;再加入2.5 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后以70%乙醇定容，靜置15 min，以空白試劑作對(duì)照，在510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品中總黃酮含量的測(cè)定。稱(chēng)取干燥后的多花黃精粉末0.5 g置于錐形瓶中，分別加入25 mL 60%乙醇溶液，超聲提取20 min;將上層液倒入離心管中，以3 000 r/min離心10 min，收集上清液即為樣品溶液。移取樣品溶液適量于25 mL具塞比色管中，于95℃恒溫水浴中揮發(fā)濃縮至小于5 mL。取出冷卻后顯色，在510 nm處測(cè)定吸光值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮濃度。進(jìn)一步參照公式（1）計(jì)算多花黃精中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精多糖

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖經(jīng)蒽酮-硫酸顯色后在582 nm下色測(cè)定吸光值，吸光值與葡萄糖濃度的線性關(guān)系如圖1所示。

圖1表明，葡萄糖濃度在2.945～20.615 mg/L范圍內(nèi)，吸光值與濃度有線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=-0.019+0.042 42 X，R=0.994，n=7。

2.1.2 樣品測(cè)定 一般認(rèn)為多糖是黃精的主要生物活性成分，也是目前中國(guó)藥典[1]評(píng)價(jià)黃精質(zhì)量的唯一可定量的指標(biāo)成分。因此，比較多糖的含量是評(píng)價(jià)黃精品質(zhì)的基本要素之一。5個(gè)不同產(chǎn)地多花黃精中多糖含量測(cè)定結(jié)果如圖2。

由圖2可知，在調(diào)查的幾個(gè)樣品中，D樣品多糖含量最高，但這5個(gè)產(chǎn)地多花黃精樣品中多糖含量均能滿(mǎn)足中國(guó)藥典以無(wú)水葡萄糖計(jì)時(shí)不得少于7.0%（按干燥品計(jì)算）的要求[1]。

2.2 黃精皂苷

2.2.1 對(duì)照樣品選擇 現(xiàn)代研究表明，多花黃精中含有甾體皂苷及三萜皂苷類(lèi)生物活性物質(zhì)[3，15]。但中國(guó)藥典[1]目前對(duì)黃精皂苷僅采用TLC方法進(jìn)行定性檢測(cè)。近年來(lái)，人們開(kāi)始關(guān)注黃精中皂苷的定量評(píng)價(jià)。雖然HPLC法具有測(cè)定單一皂苷含量的優(yōu)勢(shì)[20-21]，但存在受設(shè)備限制、耗時(shí)長(zhǎng)等特點(diǎn)，特別是多花黃精因產(chǎn)地不同而導(dǎo)致皂苷種類(lèi)、含量差異都較大，測(cè)定總量時(shí)需要多個(gè)對(duì)照樣才能排除其他物質(zhì)的干擾。比色法測(cè)定中藥材的總皂苷含量具有儀器易得、速度快，適合多個(gè)樣品總皂苷的比較。但比色法測(cè)定多花黃精總皂苷還沒(méi)有一致認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)方法，特別是沒(méi)有公認(rèn)的對(duì)照樣品，目前在實(shí)踐中較多采用的對(duì)照樣品有人參皂苷[22]及薯蕷皂苷[23]，也有人認(rèn)為菝葜皂苷較好[24]。

為了選擇最大吸收波長(zhǎng)，筆者參考上述文獻(xiàn)方法，以人參皂苷、薯蕷皂苷及菝葜皂苷的溶液以及多花黃精樣品溶液顯色后進(jìn)行波長(zhǎng)300～700 nm掃描，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，樣品溶液的最大吸收峰的波長(zhǎng)與薯蕷皂苷元的最大吸收波長(zhǎng)接近。因此筆者選擇薯蕷皂苷元作為對(duì)照樣品。

2.2.2 含量測(cè)定 以薯蕷皂苷元為對(duì)照樣品，經(jīng)顯色后在542 nm波長(zhǎng)下的吸光值，吸光值與其濃度的線性關(guān)系如圖3所示。

圖3顯示，薯蕷皂苷元的濃度在5.4～16.2 mg/L范圍內(nèi)，兩者線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=-0.005 2+0.088 04 X，R=0.994，n=5。進(jìn)一步測(cè)定多花黃精樣品總皂苷含量，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，樣品A的黃精總皂苷含量最高，E的次之，其余3個(gè)樣品相近。

2.3 黃精黃酮

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以蘆丁為對(duì)照樣品，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色后在510 nm波長(zhǎng)下的吸光值，它與濃度的線性關(guān)系如圖5所示。

由圖5可知，在蘆丁濃度為3.5～28.0 mg/L范圍內(nèi)，吸光值與濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y= -0.002 05+0.001 09 X，R=0.999，n=5。

2.3.2 樣品測(cè)定 由于多花黃精中黃酮含量較低，經(jīng)過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)探索，采取將提取樣品濃縮后測(cè)定多花黃精中的黃酮含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6結(jié)果顯示，總體而言多花黃精中黃酮含量較低，但不同的產(chǎn)地之間也存在著明顯的差異。就試驗(yàn)研究涉及的樣品而言，樣品E、C的總黃酮含量較高，樣品D的含量最低。

3 討 論

湖南為多花黃精道地產(chǎn)區(qū)，為了滿(mǎn)足優(yōu)質(zhì)道地中藥材多花黃精的種植需求，課題組從湖南多花黃精的主產(chǎn)區(qū)的湘西地區(qū)、張家界地區(qū)、婁底地區(qū)、永州地區(qū)以及四川甘孜地區(qū)各采集了3份人工栽培的多花黃精樣品，對(duì)其所含黃精多糖、總皂苷、總黃酮的含量進(jìn)行了較為系統(tǒng)的測(cè)定和分析比較。就試驗(yàn)研究收集的樣品而言，黃精多糖以?shī)涞椎貐^(qū)的最高，但上述樣品的多糖含量均符合中國(guó)藥典的要求。而總皂苷含量以永州地區(qū)的最高，黃酮含量則以張家界地區(qū)及四川甘孜地區(qū)的較高?？偟膩?lái)說(shuō)，上述5個(gè)產(chǎn)地的多花黃精中多糖、總皂苷的含量均較高，但總黃酮含量普遍較低。

多花黃精是藥食同源的多年生草本植物，因其良好的藥用和食用價(jià)值，市場(chǎng)需求量日益增長(zhǎng)。近年來(lái)，野生多花黃精因采挖過(guò)于頻繁，導(dǎo)致產(chǎn)量迅速下降，而且破壞生態(tài)環(huán)境。多花黃精為喜陰植物，適合林下種植，特別適合貧困山區(qū)的脫貧致富與美麗鄉(xiāng)村建設(shè)的需求。因此，多花黃精的引種馴化栽培作為新型的林下中藥材產(chǎn)業(yè)正在興起。研究對(duì)5個(gè)不同產(chǎn)地的多花黃精樣品中的黃精多糖、皂苷及黃酮的含量進(jìn)行了分析比較，可為南方地區(qū)多花黃精的引種馴化與規(guī)范化栽培提供科學(xué)依據(jù)。在今后的研究中，課題組還將進(jìn)一步跟蹤這些地區(qū)多花黃精的品質(zhì)，為南方地區(qū)道地中藥材多花黃精的發(fā)展提供更多更全面的科學(xué)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部）（2015年版）[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 李亞霖，周 芳，曾 婷，等. 藥用黃精化學(xué)成分與活性研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2019，25（5）：86-89.

[3] 張 嬌，王元忠，楊維澤，等. 黃精屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2019，44（10）：1989-2008.

[4] 李 澤，潘 登，沈建利，等. 黃精多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 藥物生物技術(shù)，2013，20（3）：241-244.

[5] 辜紅梅，蒙義文，蒲 薔. 黃精多糖的抗單純皰疹病毒作用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2003，9（1）：21-23.

[6] 江 華. 黃精多糖的抗腫瘤活性研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（6）：479-480.

[7] 王建新. 黃精降糖降脂作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2009，7（1）：93-94.

[8] 鄭春艷，汪好芬，張庭廷. 黃精多糖的抑菌和抗炎作用研究[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，33 （3）：272-275.

[9] 王愛(ài)梅，周建輝，歐陽(yáng)靜萍. 黃精對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老作用研究[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（2）：137-138.

[10] 李 鶯，趙 兵，陳千良，等. 雞頭黃精及其愈傷組織總皂苷含量的測(cè)定比較[J]. 北方園藝，2011（21）：167-168.

[11] 王 坤，岳永德，湯 鋒，等. 多花黃精多糖的分級(jí)提取及結(jié)構(gòu)初步分析[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2014，26（3）：364-369.

[12] 徐德平，孫 婧，齊 斌，等. 黃精中三萜皂苷的提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中草藥，2006，37（10）：1470-1472.

[13] 李小紅，楊顯輝，李 安，等. 滇黃精總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（11）：234-238.

[14] 劉彥東，黃俊學(xué)，張 權(quán)，等. 高效液相色譜-雙波長(zhǎng)法測(cè)定黃精中5種活性化學(xué)成分的含量[J]. 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2018，54（4）：398-402.

[15] 陳 輝，馮珊珊，孫彥君，等. 3種藥用黃精的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2015（15）：2329-2338.

[16] 喻祖文，張旺凡. 多倍體黃精中多糖和皂苷的提取及含量測(cè)定[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13（5）：20-22.

[17] 尤新軍，郭 蕊，王 琳，等. 黃精總皂苷超聲提取工藝研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（3）：163-166.

[18] 鄭小江，陳曉春，滕樹(shù)銳，等. 湖北省恩施州三種黃精主要有效成分及硒含量對(duì)比[J]. 湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，36（1）：12-14，21.

[19] 劉清華，高漢云，陳桂芬，等. 多花黃精中總黃酮提取工藝優(yōu)化及可視化分析[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（8）：89-93.

[20] 陳立娜，都述虎，高艷坤，等. RP-HPLC法測(cè)定黃精中薯蕷皂苷元含量[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2006，20（4）：32-34.

[21] 左雅敏，李 琛，彭興春，等. HPLC-一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃精及其飲片中6種成分的含量[J]. 中國(guó)藥房，2019，30（13）：1748-1754.

[22] 崔 婧，范桂強(qiáng)，龐紅霞，等. 正交法優(yōu)化閃式提取黃精皂苷工藝研究[J]. 中國(guó)藥師，2017，20（1）：53-55.

[23] 苑 璐，薛 潔，周 三，等. 嶗山產(chǎn)黃精總皂苷提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 食品與藥品，2015，17（1）：9-13.

[24] 趙麗蓉，羅 漢，相英龍，等. Box-Benhken響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取黃精總皂苷的條件[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2018，20（8）：1010-1015.

（責(zé)任編輯：肖彥資）