武志江 梁桂東 廖以金 黃黎芳 黃鳳珠 陸貴鋒 陳東奎 鄧海燕

摘 ?要：為探究碳離子束輻照對火龍果種子的損傷效應并且確定適宜的誘變輻照劑量，以紅肉火龍果種子為試材，采用5個不同劑量（0、15、30、45、60 Gy）的碳離子束¹²C⁶⁺進行輻照處理，觀察其對火龍果種子萌發(fā)、存活率及幼苗生長的影響。結(jié)果表明，¹²C⁶⁺離子束在輻照劑量0～60?Gy內(nèi)大多數(shù)種子均能正常萌發(fā)，對發(fā)芽率的影響不大，而對發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)存在一定的抑制作用;對幼苗苗高具有顯著的促進作用，而對根長、子葉長和寬均呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。碳離子束輻照對火龍果幼苗存活率的影響具有極顯著的劑量效應，隨劑量升高而極顯著下降?；瘕埞N子碳離子束輻照的半致死劑量（LD₅₀）為24 Gy，建議適宜輻照劑量范圍為15～30?Gy。

關鍵詞：碳離子束;火龍果;種子萌發(fā);幼苗生長;半致死劑量中圖分類號：S667.9??????文獻標識碼：A

Effect of Carbon Ion Beams Irradiation on Seed Germination， Survival and Seedling Growth of Hylocereus polyrhizus

WU?Zhijiang¹， LIANG Guidong¹， LIAO Yijin²， HUANG Lifang¹， HUANG Fengzhu¹， LU Guifeng¹， CHEN Dongkui¹， DENG Haiyan^1*

1.?Horticultural Institute， Guangxi?Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi?530007， China; 2.?College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In order to explore the damage effect of carbon ion beams?irradiation on seeds and determine?the suitable mutagenic irradiation doses， the effects of carbon ion beams on seed germination， survival and seedling growth were investigated by irradiating the dry seeds?of red pitaya （Hylocereus polyrhizus）?at various doses?of¹²C⁶⁺ion beams （0，?15，?30，?45 and 60 Gy）.?The results showed that most of the seeds could germinate normally at the irradiation doses?ranging from 0?to 60 Gy， and the effects?of carbon ion beams on the germination rate were?not significant， but some certain inhibitory effects?on germination potential and germination index?were observed. It could significantly promote the shoot?height， but inhibit the radicle?length， cotyledon length and width to varying degrees.?Carbon?ion beams irradiation had a very significant dose effect on the survival rate of the seedlings?which?significantly decreased with the irradiation dose.?The semi-lethal dose （LD₅₀） of the seeds?of red pitaya irradiated by carbon ion beams was 24 Gy. The recommended irradiation doses?is ranged?from 15?to 30 Gy. Those results would provide?dose references?and guidance for the subsequent study of carbon ion beams?mutation?breeding of?pitaya.

Keywords： carbon ion beams; pitaya; seed germination; seedling growth; semi-lethal dose

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.016

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺（Hylocereus）或蛇鞭柱屬（Selenicereus）多年生肉質(zhì)藤蔓型植物，果實外形獨特，具有較高的營養(yǎng)價值、藥用價值以及觀賞價值，原產(chǎn)于墨西哥南部及中美洲諸國的太平洋沿岸地區(qū)。我國海南、廣西等地最早引入火龍果進行種植，經(jīng)過數(shù)年的常規(guī)育種手段（芽變選種、實生選種、雜交選育等）選育出一些優(yōu)良品種。種質(zhì)資源是作物育種工作的物質(zhì)基礎，由于國內(nèi)火龍果種質(zhì)資源存在嚴重的遺傳基礎狹窄、原生種匱乏等問題，所以嚴重阻礙了火龍果的育種效率，導致目前生產(chǎn)上火龍果主栽品種類型單一，性狀趨同化嚴重，難以滿足市場對品種多樣化的需求。因此，運用各種技術手段如物理誘變、化學誘變、分子生物學技術等對現(xiàn)有火龍果種質(zhì)進行創(chuàng)新和改良，拓寬育種材料的遺傳基礎，是加快培育火龍果新品種的有效途徑之一。

重離子（荷能重的帶電粒子）作為一種新的誘變源，相比γ射線、X射線、β射線、中子和電子束等傳統(tǒng)誘變源具有傳能線密度（LET）和高生物學效應（RBE）等特點，因其具有突變率高、誘變譜廣等優(yōu)點，尤其對改良果實成熟期、果實品質(zhì)、植株抗病性等性狀效果顯著^[1]，越來越多地被應用于高等植物的誘變育種研究中^[2-6]。利用重離子輻射誘變已使多種作物成功地獲得了包括早熟、矮化、抗逆、優(yōu)質(zhì)的突變體^[4]。目前果樹的誘變育種研究多采用⁶⁰Co-γ射線作為輻射源^[7-12]，而重離子輻射誘變技術在果樹上的研究尚處于起步階段^[13]，尤其是熱帶果樹的研究仍是空白。目前有關火龍果輻射誘變的研究較少，僅有鄧仁菊等^[14-15]利用⁶⁰Co-γ射線輻射和EMS（甲基磺酸乙酯）對火龍果幼苗和枝條進行誘變育種研究。

基于前期試驗結(jié)果，本研究選定在0～60?Gy范圍內(nèi)設定不同劑量梯度的¹²C⁶⁺離子束輻照，研究其對火龍果種子萌發(fā)、幼苗生長發(fā)育以及存活率的影響，探究重離子輻照劑量與致死率的效應關系，并計算其半致死劑量，為構(gòu)建火龍果突變體庫提供輻射劑量參考，為重離子輻射誘變育種工作提供理論基礎研究和技術指導。

1??材料與方法

1.1材料

供試種子來源于紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）品種‘桂紅龍2號，其千粒重約為1.3?g。取成熟火龍果果肉，放入尼龍網(wǎng)袋中，用手揉搓使果肉與種子分離，一邊揉搓一邊用自來水沖洗掉果肉。取出倒入水中，將水中漂浮的種子和少量果肉倒掉，剩下的種子經(jīng)風干處理，即得供試種子。儲藏前去除雜質(zhì)、不飽滿、干癟或破損的種子，選取顆粒飽滿，大小均一的種子用于碳離子束¹²C⁶⁺輻照試驗。

1.2方法

1.2.1 ?輻照處理??實驗在中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器國家實驗室重離子研究裝置（HIRFL）生物輻射終端進行。所用碳離子束¹²C⁶⁺初始能量為80?MeV/u，經(jīng)由不銹鋼窗，Mylar膜和空氣照射到種子表面?；瘕埞N子平鋪于Corning培養(yǎng)皿（直徑為35?mm）中，種子平均厚度為5?mm。輻照實驗在常溫常壓下進行，樣品更換和數(shù)據(jù)獲取由計算機控制?；谇捌谳椪照T變研究，輻照劑量分別設置為0（CK）、15、30、45和60?Gy，劑量率為40?Gy/min。輻照試驗重復3次。

1.2.2 ?發(fā)芽試驗??發(fā)芽試驗采用完全隨機設計，3次重復。輻照火龍果種子用10%次氯酸鈉滅菌后，用無菌水沖洗3遍，置于無菌水中浸種6 h。在發(fā)芽盒（底部為正四邊形，邊長為12?cm）底部鋪放兩層濾紙，用少量ddH₂O將濾紙濕潤，將經(jīng)過預處理的火龍果種子均勻地擺放在雙層濾紙上進行發(fā)芽試驗，然后置于（28±1）℃的人工氣候箱中進行恒溫培養(yǎng)試驗，光周期為12?h，光照強度2200?lx。每天加入適量的無菌水以保持濾紙濕潤。從種子置床之日開始，每天觀察并記錄各處理萌發(fā)的種子數(shù)（以種子發(fā)芽露白，胚根長度不小于種子半徑為準），直至連續(xù)3?d無種子萌發(fā)為止，最后計算每天發(fā)芽率、終發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率=當天累計發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×?100%;

終發(fā)芽率=第11天總發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×?100%;

發(fā)芽勢=第4天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×?100%;

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt）（Gt為t日當天的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽日數(shù)）。

1.2.3??幼苗生長發(fā)育及存活試驗??發(fā)芽結(jié)束后，幼苗再培養(yǎng)12 d，期間每天觀察幼苗的生長情況，最后從每皿中隨機選擇10株幼苗測定其苗高（從基部到子葉的距離，即下胚軸高度）、根長、子葉長、子葉寬。測定結(jié)束后，將幼苗移栽到穴盆（直徑6?cm，高10?cm）中，置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)約30?d，直至不再冒出上胚軸幼芽，即露芯為止，最后統(tǒng)計正常健康的幼苗數(shù)，計算幼苗存活率以及作用強度（大于0為促進作用;小于0為抑制作用）。

幼苗存活率=健康存活幼苗數(shù)/供試種子數(shù)×?100%;

作用強度=（處理-對照）/對照×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncans新復極差法進行多重比較。

2??結(jié)果與分析

2.1碳離子束輻照對火龍果種子萌發(fā)特性的影響

不同輻照處理的種子發(fā)芽率隨置床時間均呈“S”型變化趨勢（圖1），經(jīng)歷了快增期、緩增期和穩(wěn)定期，均在置床2?d后進入快增期，5 d趨于穩(wěn)定，8?d時發(fā)芽率最高。與對照（CK）相比，重離子輻照對種子發(fā)芽過程的前期（1～3?d）影響較大，后期（4～10?d）影響較小，差異不顯著（圖1）。重離子輻照對種子初始萌發(fā)期、發(fā)芽持續(xù)時間和終發(fā)芽率無顯著影響，各處理均在種子置床后第2天開始萌發(fā)，第11天發(fā)芽全部結(jié)束，從萌芽到發(fā)芽結(jié)束持續(xù)9～10?d，終發(fā)芽率均達到97%以上（圖1）。重離子輻照對種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均有顯著影響（P<0.05），均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（圖2、圖3）。隨著輻照劑量的升高，重離子對種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的抑制作用總體上均呈現(xiàn)增強趨勢，當劑量較低，僅為15?Gy時，對發(fā)芽指數(shù)已表現(xiàn)顯著的抑制作用（P< 0.05），發(fā)芽指數(shù)較對照降低了5.4%（圖2），而對發(fā)芽勢來說，當劑量較低（0～30 Gy）時，抑制作用不顯著，當劑量升高至45?Gy時，抑制作用達到顯著水平（P<0.05），較對照降低了12.9%（圖2）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

Different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05; different uppercase letters indicate highlysignificant difference atP<0.01.

2.2碳離子束輻照對火龍果幼苗生長發(fā)育的影響

火龍果種子經(jīng)不同劑量¹²C⁶⁺離子束輻照后，其幼苗早期的生長發(fā)育受到了極顯著影響（P< 0.01），存在劑量梯度變化（表1）。隨著輻照劑量的升高，火龍果的幼苗苗高呈現(xiàn)先升后降的“拋物線”變化趨勢（圖3）。與對照相比，輻照劑量在60?Gy內(nèi)的重離子均對苗高具有顯著促進作用（P<0.05），其促進程度隨著輻照劑量的升高逐漸增強，在30?Gy時達到最高，較對照極顯著增加了62.1%（P<0.01），而后促進作用逐漸減弱，60?Gy時最低（P<0.05）（圖3）。有趣的是，重離子輻射可使火龍果子葉的長和寬下降，濃度越高，降低幅度越大，當濃度為30?Gy時表現(xiàn)出顯著降低（表1）。這表明重離子在低劑量時對火龍果子葉的抑制強度不大，高濃度則表現(xiàn)出顯著的抑制作用，并隨劑量升高而增強。

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（PP<0.01）。

Note： Different?lowercase letters in the same column.?indicate significant difference among different treatments?（P<0.05）; and different?uppercase letters in the same row indicate highly?significant difference among different treatments?（P<0.01）.

與苗高的變化趨勢不同，幼苗根長隨著輻照劑量的升高而一直下降（圖3），這表明輻照劑量在60?Gy內(nèi)的重離子均對根長具有抑制作用。當輻照劑量達到30?Gy時抑制作用表現(xiàn)顯著（P< 0.05）且抑制強度隨劑量而升高。輻照劑量為60?Gy的重離子對火龍果幼根的抑制作用最強，抑制強度達68.0%以上（P<0.01）（圖3）。

綜上所述，¹²C⁶⁺離子束輻射劑量在60?Gy內(nèi)對火龍果早期幼苗苗高具有顯著促進作用，而對幼苗子葉和幼根的生長具有抑制作用。

2.3碳離子束輻照對火龍果幼苗存活率的影響及半致死劑量計算

在試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輻照處理的火龍果幼苗在生長早期根系盡管受到不同程度的抑制，但并未出現(xiàn)衰亡的癥狀，隨著生育進程的推進，一些幼苗無法冒出上胚軸幼芽，即無露芯現(xiàn)象，根系逐漸死亡，莖基部發(fā)黑腐爛，地上莖葉部分因莖基部死亡而斷裂倒伏（圖4）。

說明：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（PP<0.01）。

Note： Different?lowercase letters in the same column?indicate signi ficant difference among different treatments?（P<0.05）;?and different?uppe rcase letters in the same column?indicate highly?significant difference among different treatments?（P<0.01）.

苗存活率隨輻照劑量升高而極顯著下降。當輻照劑量為60?Gy時，各重復僅存有1或0個幼苗成活，平均幼苗存活率僅為（0.7±0.6）%（表2），因此，進行回歸分析時因其成活率極低，僅采用其他4個劑量點的數(shù)據(jù)進行回歸分析，求得直線回歸方程為y=-2.0889x+98.5（R²=0.9778），利用回歸方程導出火龍果的半致死劑量為24?Gy（圖5）。

3討論

重離子束經(jīng)輻照注入到生物體后通常會引發(fā)當代（M1代）損傷效應，包括原初損傷和遺傳變異^[16-17]，原初損傷主要是生理及形態(tài)發(fā)生變化，并不能遺傳給下一代（M2代）;而遺傳變異是通過單鏈DNA或雙鏈DNA的斷裂、片段的插入缺失、DNA修復等引發(fā)的基因突變進而影響性狀的改變，能夠穩(wěn)定遺傳^[18-19]。重離子束輻照對植物生長發(fā)育的影響往往具有雙重效應，低劑量常表現(xiàn)為刺激/促進效應，而高劑量表現(xiàn)抑制效應^[20-21]。在本研究中，0～60?Gy劑量的¹²C⁶⁺離子束輻照對火龍果幼苗苗高具有“拋物線”型促進效應，呈現(xiàn)明顯的“低促高抑”的趨勢。這一結(jié)果跟劉青芳等^[22]研究中小麥苗高的變化情況類似。而火龍果幼苗的其他生物學指標包括根長和子葉在相同的劑量范圍內(nèi)并未表現(xiàn)“低促高抑”的效應，而是隨著輻照劑量的升高呈持續(xù)下降的趨勢。這可能與本試驗設定的最低劑量限度有關，根長和子葉在15?Gy與對照之間并無顯著差異，因此推斷碳離子束輻照很可能在劑量0～15?Gy內(nèi)存在促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)，火龍果幼根的生長對碳離子束輻照更為敏感，抑制程度較地上部分（包括下胚軸和子葉）的生長更為嚴重，這一結(jié)果跟陳玉澤等^[18]的一致。這可能是重離子輻照對種子胚的胚根和子葉的損傷程度較胚軸大造成。種子的胚性細胞被認為是離子束輻照生物學效應的靶細胞^[23]。這些細胞的損傷可能導致種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育受到影響。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，0～60?Gy劑量范圍的重離子輻照對火龍果種子萌發(fā)的影響較小，盡管種子發(fā)芽過程中發(fā)芽速度和整齊度（發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)表征）受到一定程度的抑制，但大多數(shù)種子均能夠正常萌發(fā)，其終發(fā)芽率與對照之間差異不顯著，這與劉青芳等^[22]用¹²C⁶⁺離子束輻照小麥和羅春華等^[24]輻照3種鹽生植物的結(jié)果相似。

關于輻射誘變育種的適宜輻照劑量的確定，M1代的損傷指標（發(fā)芽勢、存活率等）因其與突變率之間有一定關系，并與輻射敏感性相對應，所以常作為確定適宜誘變劑量的參數(shù)^[25]。近年來，通常采用植株存活率50%左右的劑量作為適宜輻照劑量。另有學者選用半致死劑量上下相差20%的劑量范圍，作為產(chǎn)生更多有益突變的適宜輻照劑量。在本研究中，火龍果幼苗在生長前期未表現(xiàn)死亡癥狀，而在生長后期相繼出現(xiàn)死亡，因此存活率更適合表征火龍果種子經(jīng)輻照誘變后幼苗最終成活的參數(shù)。由火龍果幼苗存活率與輻照劑量的回歸方程得出火龍果的半致死劑量為24?Gy（R²=0.9778），這與番茄種子（LD₅₀為30?Gy左右）^[26]和菘藍種子（LD₅₀為35?Gy）^[27]的碳離子束輻照半致死劑量較為接近，另有文獻報道小麥種子的碳離子束輻照半致死劑量為55?Gy^[22]，大豆種子為100 Gy左右^[3]，這種劑量的差別可能是由于輻照率大小或種子材料不同所造成。不同種屬種子的自身特性（如種子大小、種皮厚度或硬度等）不同，對碳離子輻照的耐受能力不同，所受的損傷類型和程度也不盡相同，從而導致半致死劑量不同。

綜合考慮本研究與前期試驗（數(shù)據(jù)未發(fā)表）的結(jié)果，建議采用15～30 Gy為適宜輻照劑量，超過45?Gy則損傷增大，存活率較低（僅為7.7%），不利于篩選有益突變材料。不同品種的火龍果種子輻照敏感性可能會有差異，但輻照劑量不應低于15?Gy或高于45?Gy。下一步繼續(xù)觀測突變體材料的突變率，獲得遺傳穩(wěn)定的農(nóng)藝性狀變異的火龍果新種質(zhì)，進而研究其輻照誘變機理。

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