林秋云 謝振宇 龍開意 賀治洲

摘 ?要：光溫敏不育系的育性因易受光溫條件影響而出現(xiàn)波動，導(dǎo)致種子純度不夠，是水稻生產(chǎn)上常見的問題。本研究對1個水稻黃葉不育系突變體H08S進行溫度敏感性分析和葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察，同時通過構(gòu)建分離群體進行突變基因的遺傳模式分析。結(jié)果表明，突變體H08S的表型受溫度影響，為低溫表達型葉色突變體，且其葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，表現(xiàn)類囊體的片層結(jié)構(gòu)減少，說明H08S基因的突變影響葉綠體的正常發(fā)育。突變體H08S分別與‘日本晴、‘02428構(gòu)建F₂群體和BC₁F₁群體，觀察并統(tǒng)計群體植株葉色表型的分離情況，并進行卡方檢驗，結(jié)果表明該突變性狀受1對隱性單基因控制。

關(guān)鍵詞：水稻;黃葉不育系突變體;H08S;表型;遺傳中圖分類號：S511??????文獻標(biāo)識碼：A

Phenotypic Characteristics and Genetic Analysis of a Rice PTGMS Line Mutant H08S?with Yellow Leaf

LIN Qiuyun， XIE Zhenyu， LONG Kaiyi， HE Zhizhou^*

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： PTGMS lines are susceptible to light and temperature conditions during their fertility sensitive period， which results in fertility fluctuation and seriously affects the purity of the original or hybrid seeds of the male sterile lines. In this paper， the temperature sensitivity and chloroplast ultrastructure of a rice PTGMS mutantH08S with yellow leaf were analyzed， and the genetic model of the mutant gene was analyzed by constructing two segregated populations. The results showed that the phenotype of mutantH08Swas affected by temperature， and it was a low temperature expression type of leaf color mutant. The chloroplast structure of mutantH08S was abnormal， and the lamellar structure of thylakoid was reduced. This indicated that the mutation ofH08S gene affected the normal development of chloroplast. F₂ population and BC₁F₁ population were constructed with mutantH08Sand ‘Nipponbare and ‘02428， respectively. The isolation of leaf color phenotypes was observed and counted， and chi-square test was carried out. The results showed that the mutant trait was controlled by a pair of recessive single genes.

Keywords： rice; a rice PTGMS line?mutant with yellow leaf;H08S; phenotype; heredity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.006

葉色突變體絕大部分都表現(xiàn)出葉綠素含量降低，而且多數(shù)會影響光合效率，有些葉色突變體甚至不能存活，有些葉色突變體即便能結(jié)實，其產(chǎn)量往往會顯著降低，因此在過去很長一段時間都被認為是無意義的突變。隨著水稻功能基因組學(xué)的快速發(fā)展，大量研究表明葉色突變體不僅是開展光合作用、光形態(tài)建成、葉綠素合成和葉綠體發(fā)育等基礎(chǔ)研究的理想材料^[1]，而且其變異葉色表型可作為一種明顯且易于識別的遺傳形態(tài)標(biāo)記，在育種上簡化雜交稻種子純度鑒定工作，很大程度上減少了種子純度鑒定時間^[2-3]。

‘深08S是目前生產(chǎn)上應(yīng)用較廣的水稻光溫敏兩用核不育系，其不僅保留了‘Y58S抗性好、配合力高的特點，還增強了抗稻瘟病、抗倒性、抗逆性等特性，已成為雜交水稻的重要骨干親本。黃葉不育系突變體H08S是沈建凱等^[4]在海南種植‘深08S時發(fā)現(xiàn)的1個自然突變體。沈建凱等^[4]為了研究突變體H08S的配合力，將‘02428等共15個品種作為父本，分別與突變體H08S進行雜交獲得雜交種子，對F₁代進行產(chǎn)量特性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)配組的雜交品種的產(chǎn)量優(yōu)勢較好，增產(chǎn)組合品種率高，說明突變體H08S的雜交組合優(yōu)勢較強。由于H08S攜帶黃葉標(biāo)記，所以比野生型‘深08S更具有生產(chǎn)應(yīng)用價值。本研究擬對突變體H08S的表型性狀、細胞學(xué)特性和遺傳模式進行分析，以期為挖掘新的水稻葉色基因和促進H08S葉色突變基因在水稻育種、種子生產(chǎn)和種子純度鑒定上的應(yīng)用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 材料

突變體H08S是光溫敏兩用核不育系‘深08S的一個黃葉自然突變體。2017年7月將‘深08S和突變體H08S種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所海南省儋州市水稻綜合試驗基地，水稻種植行距20?cm，株距13.3?cm，每穴1苗，田間水肥病蟲管理同常規(guī)大田，種子完全成熟后收獲并曬干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?方法

1.2.1 ?溫敏試驗處理前浸種催芽??將‘深08S和突變體H08S種子在室溫下浸種2 d，隨后置于智能型光照培養(yǎng)箱（武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司，型號HP400G-C）中設(shè)定30?℃條件下催芽0.5?d。

1.2.2 ?不同生長溫度的處理??將催芽后的‘深08S和突變體H08S種子種植在光照培養(yǎng)箱中[光照強度為160??mol/（m²·s），空氣相對濕度為85%]，分別設(shè)定恒溫、變溫和長日照生長條件（見表1），生長2周后進行表型觀察和色素含量測定。

1.2.3 ?光合色素含量測定?‘深08S和突變體H08S在不同恒溫條件下生長2周后，分別對第1不完全葉和第2葉進行光合色素含量測定，測定方法參照Li等^[5]的方法。將所取葉片剪成約2～

3?mm的碎片，稱量剪碎的新鮮樣品約20～30 mg，重復(fù)3次，加入5?mL的95%乙醇后置于室溫黑暗中避光放置48?h，期間多次混勻，直到葉片完全發(fā)白。提取完畢，用DU800紫外-可見分光光度計在黑暗條件下測定波長為470、649、665?nm下上清液的吸光值。根據(jù)以下公式計算色素濃度：

葉綠素a濃度C_a= 13.95D₆₆₅?6.88D₆₄₉

葉綠素b濃度C_b= 24.96D₆₄₉?7.32D₆₆₅

胡蘿卜素濃度C_x=（1000D₄₇₀?2.05C_a?114C_b）/?245

再依據(jù)以下公式換算出組織中各細胞色素的含量：

細胞色素的含量（mg/g）=（葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重

1.2.4 ?葉綠體超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察??分別取20?℃恒溫條件下生長2周的‘深08S和突變體H08S的第2葉，橫切成數(shù)段，每段約2?mm，置于3%的戊二醛固定液，抽氣，室溫固定12?h，4?℃保存。將樣品送至中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所電鏡實驗中心進行樣品制備和透射電鏡觀察。

1.2.5 ?突變體H08S的遺傳模式分析??將突變體H08S與‘日本晴雜交獲得F₁，并自交獲得F₂，將突變體H08S與‘02428雜交并回交獲得BC₁F₁。將催芽后的‘深08S、突變體H08S和F₁、F₂、BC₁F₁群體的種子種植在光照培養(yǎng)箱中，在恒溫20?℃等晝夜生長條件下生長2周后，觀察并統(tǒng)計F₁、F₂、BC₁F₁群體的葉色表型和分離情況，并進行卡方測驗，分析突變體H08S的遺傳模式。

2 ?結(jié)果與分析

2.1突變體H08S的溫度敏感性分析

‘深08S和突變體H08S分別在等晝夜長的恒溫20、30?℃條件下生長2周（圖1），突變體

A～D：野生型和突變體H08S在不同溫度下的表型觀察;E～H：野生型和突變體H08S在不同溫度下葉片葉綠素含量測定。

‘深08S-L1、‘深08S-L2、H08S-L1、H08S-L2分別表示生長2周時野生型第1片葉、野生型第2片葉、突變體第1片葉、突變體第2片葉。Chla：葉綠素a;Chlb：葉綠素b;Car：類胡蘿卜素。

A-D： Phenotypes of 2-week old wild type andH08Splants under different temperature conditions，?E-H：?Pigment contents of 2-week old WT andH08S plants under different temperature conditions （mg·g^-1FW）. ‘Shen 08S-L1， ‘Shen 08S-L2，H08S-L1 andH08S-L2 mean the first and second leaf in 2-week old wild type andH08Srespectively.

H08S在20?℃條件下葉片黃化表型明顯，光合色素含量明顯降低（圖1A、E），而在30?℃下肉眼觀察‘深08S與突變體H08S的葉片葉色幾乎無差異（圖1B）。將‘深08S和突變體H08S在變溫條件下（光照12 h-30?℃/黑暗12 h-20?℃）生長2周，結(jié)果如圖1C和圖1G所示，突變體H08S的葉片黃化程度減弱，而延長光照時間（光照15?h-30?℃/黑暗9?h-20?℃），結(jié)果如圖1D和圖1H所示，肉眼觀察突變體H08S的葉片黃化程度不明顯，其接近野生型的表型。這些結(jié)果表明，突變體H08S的表型受溫度影響，為低溫表達型葉色突變體。

2.2 突變體H08S的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

突變體H08S在20?℃生長條件下表現(xiàn)出極為明顯的黃化表型和葉綠素含量減少。為了了解該基因突變是否影響到葉綠體的發(fā)育，本研究通過透射電鏡觀察突變體H08S第2葉黃化葉片中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。如圖2A與圖2D所示，突變體H08S的葉綠體數(shù)目與野生型相比無顯著差異。然而突變體H08S的葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常（圖2B與圖2E），與野生型的葉綠體結(jié)構(gòu)相比，其類囊體的片層結(jié)構(gòu)顯著減少（圖2C與圖2F），說明突變體H08S的葉綠體發(fā)育不正常，H08S基因的突變影響其葉綠體的正常發(fā)育。

2.3 突變體H08S的遺傳模式分析

突變體H08S與‘日本晴雜交獲得的F₁代植株葉片均表現(xiàn)正常綠色，而自交后的F₂代群體分離出葉色差異明顯的正常綠苗和黃化苗。突變體H08S與‘02428雜交后F₁代植株葉片也都表現(xiàn)正常綠色苗，測交后代BC₁F₁分離出現(xiàn)正常綠苗和黃化苗?？ǚ綔y驗結(jié)果表明，F(xiàn)₂代群體中綠苗與黃化苗的分離比例符合3∶1，BC₁F₁群體中綠苗與黃化苗的分離比例符合1∶1（表2），說明該突變性狀受1對隱性單基因控制。

Cp：葉綠體;Thy：內(nèi)囊體;OB：嗜鋨體;比例尺為5.0 μm（A，D）、2.0 μm（B，E）和500 nm（C，F(xiàn)）。

Cp：?chloroplast; Thy：?thylakoid lamellae; OB：?osmiphilic body; Bars=5.0 μm in A and D，?2.0 μm in B and E，?500 nm in C and F.

3 ?討論

目前已發(fā)現(xiàn)的葉色突變體的表型非常豐富，很難找到完善的分類方法來區(qū)分所有的葉色突變體。若從葉色標(biāo)記表達受溫度影響程度來區(qū)分，則葉色突變體分為低溫表達型、高溫表達型和溫鈍型3種^[6]。其中，大多數(shù)屬于低溫表達型，如已報道的水稻葉色突變體v1、v2、W1、W17、W25 和tsc-1以及本研究中的突變體H08S，在低溫20?℃條件下均出現(xiàn)顯著的不正常葉色表型，而當(dāng)生長溫度提升到30?℃時，這些突變體的葉色轉(zhuǎn)為淺綠或正常綠色^[7-9]。此外，已有研究表明，葉色突變體表型還受不同光強、不同光質(zhì)或光照時間的影響，因此葉色突變體又可分為依賴于光誘導(dǎo)型和非依賴于光誘導(dǎo)型^[10]。

大部分水稻葉色突變性狀受1對隱性核基因控制，而由顯性基因控制或是細胞質(zhì)基因控制的葉色突變體非常少見^[11]。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已有超過130個水稻葉色突變基因被定位^[12]，遍及水稻基因組12條染色體。遺傳分析表明突變體H08S受1對隱性單基因控制，其候選基因仍有待下一步研究。

近年來，育種家越來越關(guān)注葉色突變體的葉色變異表型在育種上的應(yīng)用。目前成功地實現(xiàn)葉色標(biāo)記在不育系上的應(yīng)用分有2種類型，一是全生育期均出現(xiàn)變異葉色表型;二是變異葉色表型只在生育期中某一階段表達。不育系H08S攜帶黃化葉色突變表型，且其作為兩系不育系，配組自由，比三系法更容易培育出抗性更好、產(chǎn)量更高和品質(zhì)更優(yōu)的雜交水稻組合，對優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交水稻新品種的選育具有重要的應(yīng)用價值。

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