肖圖艦 馬玉華 袁啟鳳 解璞 毛永亞 嚴(yán)佳文 廖仕琴

摘 ?要：節(jié)律鐘輸出基因GIGANTEA通過光周期途徑促進(jìn)植物開花，為研究火龍果GIGANTEA同源基因功能，應(yīng)用RT-PCR克隆獲得該基因的開放閱讀框序列，命名為Hylocereus polyrhizus GIGANTEA（HpGI），GenBank登錄號為MK609546。序列分析結(jié)果表明，HpGI開放閱讀框長度為3537?bp，編碼1178個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，HpGI與甜菜BvGI、菠菜SoGI、絲石竹GpGI的分子進(jìn)化距離較近。預(yù)測HpGI定位于細(xì)胞核，無信號肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，屬于非分泌蛋白?；虮磉_(dá)分析結(jié)果表明，HpGI基因在莖和花芽中的表達(dá)量顯著高于莖芽、果皮和根;相比對照，延長光周期處理8 d時，其表達(dá)量顯著上調(diào)。推測HpGI基因可能通過光周期途徑促進(jìn)火龍果開花。

關(guān)鍵詞：火龍果;GIGANTEA同源基因;克隆;表達(dá)分析中圖分類號：S59; S813.3??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Molecular Cloning and Expression Analysis of Rhythms Clock Output GeneHpGI from Hylocereus polyrhizus

XIAO Tujian¹，?MA Yuhua¹， YUAN Qifeng¹， XIE Pu¹， MAO Yongya¹， YAN Jiawen^1*， LIAO Shiqin²

1. Institute of Pomology， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China; 2. Fruit Industry Development Office of Luodian County， Luodian， Guizhou 550100， China

Abstract： Rhythms clock output geneGIGANTEApromotes?flowering via the photoperiod pathway. To analysis the function ofGIGANTEAhomologous gene in pitaya [Hylocereus polyrhizus （Weber） Britton & Rose]， the open reading frame （ORF） sequence was cloned through RT-PCR. The ORF ofHylocereus polyrhizus GIGANTEA（HpGI） is 3537 bp， encoding?1178 amino acids， and the GenBank accession number is MK609546. The phylogenetic analysis showed?that HpGI andBeta vulgarisGIGANTEA are the closest in?molecular evolution distance， followed bySpinacia oleraceaGIGANTEA andGypsophilapaniculateGIGANTEA. It was speculated that HpGI was located in the nucleus， and it was a?non-secretory protein. No signal peptide?and transmembrane helix domain were found.?The results of quantitative RT-PCR revealed that the expression level ofHpGI gene in the stem and flower bud was significantly higher than that in the stem bud， peel and root. Moreover， the transcription of theHpGIgene was significantly induced by the 8?d night-breaking treatment， compared to the untreated samples. It was deduced thatHpGImay promote flowering via the photoperiod pathway in pitaya.

Keywords： Hylocereus polyrhizus;GIGANTEA homologous gene; cloning; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.003

火龍果（Hylocereusspp.）是典型的長日照植物，其中紅肉類型的臨界日照時長為12 h^[1]。在北半球地區(qū)，火龍果的自然花期為5—10月^[2]，采用人工補光方式延長光周期可誘導(dǎo)火龍果在非自然產(chǎn)期開花，實現(xiàn)周年生產(chǎn)^[2]。在溫度適宜、植株無花果負(fù)載的情況下，持續(xù)補光15～45 d即可誘導(dǎo)紅肉類型火龍果的花芽形成和發(fā)育^[3-4]，火龍果成花與光照時間密切相關(guān)。

植物成花受自身遺傳因子和外界環(huán)境因素的共同影響，光周期是主要成花途徑之一^[5-6]。植物節(jié)律鐘輸出基因GIGANTEA（GI）是光周期途徑調(diào)控開花的關(guān)鍵基因之一^[7]，通過應(yīng)答光周期信號進(jìn)而調(diào)控CONSTANS（CO）和flowering locus T（FT）等開花促進(jìn)基因^[8-9]。在長日照條件下，擬南芥（Arabidopsis thaliana）GI基因突變體開花時間延遲^[10]，而超表達(dá)GI能讓擬南芥提早開花^[11]。長日照單子葉模式植物二穗短柄草（Brachypo-dium distachyon）的GI同源基因表達(dá)產(chǎn)物也能促進(jìn)開花^[12]。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將BoGI反義鏈導(dǎo)入甘藍(lán)（Brassica oleracea）后，其花期明顯推遲^[13]，說明BoGI行使促進(jìn)成花功能。GI同源基因在上述長日照植物中具有功能保守性，而在水稻（Oryzasativa）、大豆（Glycine max）和牽?；ǎ?em>Pharbitis?nil）等短日照植物中的作用卻不盡相同。超表達(dá)OsGI在長、短日照情況下均導(dǎo)致水稻延遲開花^[14-15];在牽牛花中過表達(dá)PnGI同樣可以延遲花期^[16]，而大豆GmGI能與FKF1/FKF2蛋白互作而促進(jìn)開花^[17]。GI及其同源基因的功能在不同日照類型的植物中存在一定的差異。國內(nèi)外關(guān)于火龍果光周期途徑調(diào)控成花的研究報道較少，鑒定火龍果GI同源基因并分析其功能具有重要意義。

本研究以自交親和型火龍果新品系黔蜜龍為試驗材料，克隆獲得了GI同源基因編碼區(qū)的cDNA序列并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式分析，以期為進(jìn)一步研究火龍果GI同源基因功能奠定基礎(chǔ)，為基于延長光周期的火龍果產(chǎn)期調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1 材料

以黔蜜龍火龍果[Hylocereuspolyrhizus（Weber）Britton & Rose]為材料，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部火龍果種質(zhì)資源保護(hù)貴州創(chuàng)新基地（25°21′18′′～?25°21′27′′N，105°46′14′′～105°46′36′′E）進(jìn)行補光處理，具體參考嚴(yán)佳文等^[18]的方法。采集處理1、8、15、21?d和相應(yīng)對照2年生向陽面結(jié)果枝刺座周圍約1?cm²見方的肉質(zhì)莖，以及自然條件下生長的火龍果根、莖、莖芽、花芽和果皮（花謝后10?d）。所有樣本采集時間均為15：00時左右，3次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后保存在?80?℃超低溫冰箱備用。

1.2方法

1.2.1 ?RNA提取及cDNA合成??采用TRIzol試劑提取火龍果總RNA，具體方法參照試劑說明書（Invitrogen，美國）。用NanoDrop 2000檢測總RNA的濃度和純度，Agilent 2100測定RNA完整性。選取RIN值≥7.0、OD_260/280≥1.8、OD_260/230≥1.5的總RNA用于cDNA合成，具體方法參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（Promega，M1701，美國）。

1.2.2 ?基因克隆和測序??根據(jù)前期獲得的uni-gene序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計GI同源基因的擴(kuò)增引物，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系為20?μL，包含10×PCR buffer 2.0?μL、10 mmol/L的dNTPs 2?μL、2.5?μmol/L的引物HpGI-F、HpGI-R各2?μL，TaqDNA聚合酶（TaKaRa，RR02MQ，大連）1?U，cDNA 2?μL，去離子水補充體積至20?μL。PCR反應(yīng)程序為：94?℃預(yù)變性4 min;94?℃變性30 s，58?℃復(fù)性45 s，72?℃延伸4 min，35次循環(huán);最后72?℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并以膠回收試劑盒（Trans-Gen Biotech，北京）進(jìn)行純化?；厥掌尾捎胮MD18-T克隆試劑盒（TaKaRa，大連）進(jìn)行TA克隆，隨機(jī)選取5個陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF finder程序（https：//www.ncbi.nlm.?nih.gov/orffinder/）預(yù)測目的基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）并獲得氨基酸序列。

1.2.3 ?序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建??應(yīng)用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白分子量、等電點和疏水性。應(yīng)用Predict-Protein（https：//www.predictprotein.org/）在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。應(yīng)用PSORT在線工具（http：//www.psort.hgc.jp/）、TMHMM Serverv.?2.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和SignalP Serverv.3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/?SignalP-3.0/）分別進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析、跨膜螺旋區(qū)預(yù)測和信號肽預(yù)測。應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析程序SMART（http：//www.smart.embl.de/）預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載已報道的其他植物的GI蛋白序列，應(yīng)用MEGA7.0軟件進(jìn)行GI蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對，設(shè)置自展值為1000，以Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 ?定量RT-PCR分析??根據(jù)火龍果HpGI基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計定量RT-PCR引物，引物信息見表1。應(yīng)用BIO-RAD CFX?Connect?熒光定量PCR儀分析HpGI的相對表達(dá)量。定量RT-PCR反應(yīng)體系為20??L，具體參照定量PCR試劑盒（Applied Biosystems^? Cat： 4367659）說明書。內(nèi)參基因引物、定量RT-PCR程序和數(shù)據(jù)計算、統(tǒng)計方法均參考嚴(yán)佳文等^[18]的方法。試驗設(shè)置生物學(xué)重復(fù)、技術(shù)重復(fù)各3次。

2??結(jié)果與分析

2.1HpGI基因克隆

以cDNA為模板，應(yīng)用引物HpGI-F、HpGI-R擴(kuò)增GI同源基因序列。凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期的3686 bp接近（圖1）。測序得到的堿基序列與前期獲得的unigene序列僅有2個堿基差異，一致性為99.95%。應(yīng)用ORF finder預(yù)測ORF長度為3537 bp，將該GI同源基因序列命名為HpGI，GenBank登錄號為MK609546。

2.2HpGI基因生物信息學(xué)分析

2.2.1HpGI編碼蛋白理化性質(zhì)分析HpGI編碼1178個氨基酸組成的蛋白，分子量為129.196?kDa，等電點6.45，帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）數(shù)量為124，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）數(shù)量為115，不穩(wěn)定指數(shù)50.69，平均疏水性值為?0.072，屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位和信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，沒有信號肽輸出位點，也沒有線粒體靶向肽和葉綠體轉(zhuǎn)運肽，屬于非分泌蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白無跨膜螺旋區(qū)，這一預(yù)測結(jié)果與其定位于細(xì)胞核內(nèi)相符。

2.2.2HpGI編碼蛋白結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹分析??將HpGI編碼的氨基酸序列與甜菜（Beta vulgaris）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryzasativa）和玉米（Zea mays）這幾個代表性物種的GI同源蛋白進(jìn)行序列比對，與BvGI的一致性高達(dá)85.41%，與AtGI、OsGI和ZmGI一致性分別為72.51%、69.09%和68.78%（圖2），HpGI與以上4種植物GI蛋白均存在保守的氨基酸殘基（圖2黑色背景部分）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明HpGI的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲分別占比50.9%、4.8%和44.3%。

為進(jìn)一步明確HpGI與其他植物GI同源蛋白之間的親緣關(guān)系，構(gòu)建了HpGI與甜菜（Beta vulgaris，Bv）、菠菜（Spinacia oleracea，So）、絲石竹（Gypsophilapaniculata，Gp）、大櫻桃（Prunus avium，Pa）、葡萄（Vitisvinifera，Vv）、桃（Prunus persica，Pp）、甘藍(lán)（Brassica oleracea，Bo）、棗（Ziziphus jujuba，Zj）、大豆（Glycine max，Gm）、枇杷（Eriobotryajaponica，Ej）、番薯（Ipomoea batatas，Ib）、番荔枝（Annona squamosa，As）、菊花（Chrysanthemum morifolium，Cm）、黑麥草（Lo-lium perenne，Lp）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、水稻（Oryzasativa，Os）、玉米（Zea mays，Zm）和苜蓿（Medicago truncatula，Mt）的GI同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，18種GI同源蛋白分成雙子葉亞族和單子葉植物亞族，HpGI與擬南芥等同屬于雙子葉植物亞組（圖3）。HpGI與甜菜BvGI（XP 010681268.1）的分子進(jìn)化距離最近，其次是菠菜SoGI（XP 021849292.1）和絲石竹GpGI（BAW15106.1）。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步說明HpGI是節(jié)律鐘輸出基因GI的同源基因。

2.3HpGI表達(dá)分析

應(yīng)用定量RT-PCR分析了HpGI基因在火龍果不同組織和光照處理材料中的表達(dá)情況。HpGI在根、莖、莖芽、花芽和果皮中均表達(dá)，其中莖和花芽中的表達(dá)量顯著高于莖芽和果皮（P< 0.05），根中的表達(dá)量最低（圖4）。光照處理1?d時，HpGI表達(dá)量與對照無顯著差異;處理8?d時，

其表達(dá)量（11.94±3.26）顯著高于處理1 d（2.20±?0.24）和對照（2.14±0.48）（P<0.05）;處理15和21 d時，其表達(dá)量恢復(fù)到1 d時的水平，而各對照樣品中的表達(dá)量無顯著差異（圖5）。

3討論

GI基因最初從擬南芥中克隆，編碼含有1173個氨基酸的蛋白^[7]。近年來，研究者們從其他植物中克隆到GI同源基因所編碼蛋白大小存在一定的差異。黑麥草LpGI（CAY26028.1）最小，含1148個氨基酸，而棗ZjGI（XP_015886353.1）含有1181個氨基酸。本研究克隆的火龍果GI同源基因開放閱讀框序列為3537 bp，編碼1178個氨基酸，大小與擬南芥AtGI（NP_564180.1）和棗ZjGI更接近。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，火龍果HpGI（MK609546.1）既沒有信號肽輸出位點和跨膜螺旋區(qū)，也沒有線粒體靶向肽和葉綠體轉(zhuǎn)運肽，定位于細(xì)胞核，屬于非分泌蛋白，這與菊花^[19]、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）^[20]、番荔枝^[21]和番薯^[22]等植物中的研究結(jié)果一致。HpGI與其他GI同源蛋白的序列比對結(jié)果顯示，HpGI與甜菜BvGI的一致性高達(dá)85.41%，與擬南芥、水稻和玉米的GI蛋白一致性分別為72.51%、69.09%和68.78%，且存在多處高保守性的氨基酸殘基。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，HpGI與AtGI、BvGI等同屬于雙子葉植物亞族。以上結(jié)果表明，HpGI是節(jié)律鐘輸出基因GI的同源基因。

在光周期途徑調(diào)控植物開花的過程中，GI基因感受和響應(yīng)光敏色素和生物節(jié)律鐘信號進(jìn)而調(diào)控下游開花相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平^[7-9]。HpGI基因在火龍果的根、莖、莖芽、花芽和果皮中均有表達(dá)，但在莖、花芽中的表達(dá)量顯著高于其他組織，在根中的表達(dá)量最低。前人研究表明：甘藍(lán)型油菜BnGI在不同組織中表達(dá)情況為分生組織>莖>葉>花蕾>果實>根^[20];番荔枝AsGI在葉片、花蕾中的表達(dá)量高于頂芽和果實^[21]。HpGI與BnGI、AsGI的表達(dá)模式較為一致，這可能是因為葉（莖）和花是感受光周期和響應(yīng)生物節(jié)律信號更為敏感的部位。人工補光處理8 d后，HpGI在火龍果莖中的表達(dá)量顯著高于對照和處理1?d時，而對照中的表達(dá)量始終無顯著變化。短日照植物菊花暗處理13 d后，CmGI表達(dá)量顯著上調(diào)^[19]。采用補光措施延長長日照植物的光周期，或者采用遮光措施縮短短日照植物的光周期，均能誘導(dǎo)GI同源基因的表達(dá)量上調(diào)而促進(jìn)開花。綜上所述，HpGI基因可能在延長光周期而誘導(dǎo)火龍果成花的過程中發(fā)揮作用。

本研究克隆了火龍果GI同源基因，命名為HpGI。通過生物信息學(xué)、組織特異性和延長光周期后的基因表達(dá)分析，初步研究了該基因表達(dá)產(chǎn)物的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系及其對光周期的響應(yīng)特征，為進(jìn)一步闡釋其功能奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究擬將HpGI基因?qū)霐M南芥GI突變體，驗證其功能。此外，通過分析與之互作或受其調(diào)控的光周期途徑成花相關(guān)基因的表達(dá)模式，從分子水平揭示HpGI的作用機(jī)制。

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