李晨 孫培明 莫玲 李玲 徐文豪 李峰

中圖分類號：S858.32? ? ?文獻標識碼：C? ? ?文章編號：1673-1085（2020）7-0047-03

櫻桃谷肉鴨具有生長快、飼料轉(zhuǎn)化利用率高等優(yōu)點，是我國目前規(guī)模化養(yǎng)殖的主要肉鴨品種，但在飼養(yǎng)中疫病問題一直存在。其中鴨傳染性漿膜炎是櫻桃谷肉鴨規(guī)模養(yǎng)殖常見主要疫病之一[1]。該病的發(fā)生可貫穿商品肉鴨整個生長周期，特別是2～3周齡雛鴨易發(fā)，發(fā)病率在5%～90%，病死率高達80%或以上[2，3]。2020年3月份，濱州某櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖場發(fā)生疑似鴨傳染性漿膜炎，現(xiàn)就其診斷與防治情況總結(jié)如下，以期為該病綜合防控提供借鑒與參考。

1? 材料與方法

1.1? 病料來源及記錄發(fā)病情況? 濱州某養(yǎng)殖場送檢病死鴨，記錄其臨床發(fā)病癥狀，剖檢觀察其病理變化。

1.2? 試劑材料? 胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB），購自Dfico公司;麥康凱瓊脂，購自青島海博生物技術(shù)有限公司;微量生化發(fā)酵管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司;SPAReasy細菌基因組DNA快速提取試劑盒、2×Spark Taq PCR Master Mix（Spark Taq DNA 聚合酶、DNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液）、DL2000 DNA Marker等，購自山東思科捷科學儀器有限公司;革蘭氏染液、瑞士染液、超純水等，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院制備;鴨疫里默菌（RA）參考菌株JX-1，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院分離鑒定并保存。

1.3? 細菌分離與培養(yǎng)? 無菌條件下，采集病死鴨肝臟、脾臟、腦組織，劃線接種含有50mL/L的TSA，置于燭缸中，37℃溫箱培養(yǎng)24～48h;同時，劃線接種麥康凱平板，37℃溫箱培養(yǎng)18～24h。觀察菌落長出情況。

1.4? 分離菌生化試驗? 挑取分離菌純培養(yǎng)物，無菌接種于微量生化發(fā)酵管，37℃溫箱培養(yǎng)48h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5? PCR診斷

1.5.1? 引物設(shè)計? 參照文獻[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成一對特異性引物RA-F和RA-R。

RA-F：5'-GACTATACAGGTCTTACGTTCCCT

GT-3';

RA-R： 5'-TAACTGAGATGGGTTAACACCTCTA

GC-3'。

1.5.2? 模板DNA制備? 挑取TSA單個菌落，通過振蕩培養(yǎng)30min，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取制備DNA模板。取RA JX-1株純培養(yǎng)單個菌落，同樣方法提取制備DNA模板，作為對照。同時取ddH2O作為空白對照。

1.5.3? PCR反應(yīng)體系? 反應(yīng)體系為25μL：12.5μL 2×Spark Taq PCR Master Mix，上下游引物各0.25μL，5μL模板，7μL ddH2O。反應(yīng)程序為95℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30個循環(huán);最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6? 藥敏試驗? 采用紙片法進行，按照《抗生素藥物藥敏試驗判斷標準》判定記錄結(jié)果。

2? 結(jié)果

2.1? 臨床特征與病理剖檢? 該場本批次飼養(yǎng)有10000只商品肉鴨，送檢時約為16日齡，已發(fā)病4d左右。主訴表現(xiàn)為發(fā)病鴨精神沉郁，縮頸呆立，步態(tài)不穩(wěn)，跛行或頭頸扭斜，伴有頭部震顫等神經(jīng)癥狀，排黃綠色或白綠色稀便，病死鴨呈角弓反張等癥狀。每天死亡50～100只不等，死亡率約為5%。剖檢病死鴨，均為典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎等纖維素滲出特征，肝臟、脾臟腫大，肺臟出血、淤血，喉頭有粘液。

2.2? 細菌分離與培養(yǎng)特征? 肝臟、脾臟、腦組織等病料接種TSA，燭缸培養(yǎng)24h，均有菌落長出，而麥康凱瓊脂平板上無菌落長出。挑取單個菌落，接種TSA、TSB純化培養(yǎng)，同時分別涂片革蘭氏、瑞士染色鏡檢。TSA純培養(yǎng)菌落直徑多為1～2mm，邊緣整齊、微隆起、半透明，呈晶瑩光滑黃油狀。革蘭氏染色鏡檢，可見紅色小桿菌，無芽孢，單個或成雙存在，有的菌體連接為一串，呈弧狀、長絲狀。瑞士染色呈兩極濃染。

2.3? 生化特征? 分離菌不分解葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、水楊苷，VP試驗、硝酸鹽還原試驗、尿素酶試驗、明膠液化試驗均為陰性，不產(chǎn)生H2S，符合鴨疫里默菌的生化特征[5]。

2.4? PCR檢測結(jié)果? 經(jīng)檢測，分離菌與參考菌均在860bp處擴增出目的條帶，空白對照無任何條帶擴出，見圖1。

2.5? 藥敏試驗結(jié)果? 分離菌對頭孢噻呋、大觀霉素高敏，對卡那霉素、新霉素中敏，對鏈霉素、克林霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、多粘菌素、氟苯尼考、利福平耐藥。

3? 分析與討論

3.1? 通過臨床特征、病理剖檢、細菌分離、生化試驗及PCR檢測，確診引起該場發(fā)病的病原為鴨疫里默菌。通過藥物敏感性試驗，推薦遴選敏感藥物大觀霉素用于臨床治療。跟蹤反饋意見，防治效果良好。

3.2? 鴨疫里默菌能通過污染的飼料、飲水、飛沫等經(jīng)呼吸道、消化道及皮膚表面?zhèn)诘榷喾N途徑引起鴨群發(fā)病[6]。其臨床特征與鴨大腸桿菌病、沙門氏菌病等具有相似性。由于缺乏合適的選擇性培養(yǎng)基，常規(guī)的細菌培養(yǎng)鑒別方法費時費力?；?6S rRNA基因序列或RA的外膜蛋白A基因保守序列設(shè)計引物，建立的PCR檢測方法、熒光定量PCR檢測方法[7-9]等具有特異性強、敏感性高等優(yōu)勢，且可以實現(xiàn)對病料組織的直接測定，大大縮短診斷時間，已成為該病快速診斷的有效方法。

3.3? 該病的防控措施主要有疫苗免疫與藥物防治，一般認為該菌血清型眾多，且不同血清型缺乏理想的交叉保護[10，11]，提高了疫苗制備的難度。但分析藥敏試驗結(jié)果，分離菌存在多重耐藥，單純依靠藥物防治亦有其局限性。劉建濤等[12]試驗發(fā)現(xiàn)，免疫鴨傳染性漿膜炎三價疫苗，能有效提高成活率2.1%，且料肉比有所降低。因此，在鴨傳染性漿膜炎通用疫苗研發(fā)上市之前，選擇區(qū)域優(yōu)勢血清型進行疫苗制備，結(jié)合藥敏試驗選擇敏感性藥物進行防控是最佳組合措施。

參考文獻：

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[12]? 劉建濤，尚友國，李旭源.鴨傳染性漿膜炎三價滅活疫苗對提高白羽肉鴨生產(chǎn)性能指標的觀察[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2019，12：1-2.