李容念 ，趙文博 ，趙平 ，朱偉 ，郭建軍 ，席家祥 ，趙瑞成

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208;2.湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙 410006;3.河北省尚義縣醫(yī)院，張家口 076750)

內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells， NSCs)在成人腦組織中主要分布于側(cè)腦室下層(SVZ)和海馬齒狀回兩處[1]，具有干細(xì)胞多分化潛能的生物學(xué)特性，可通過定向誘導(dǎo)增殖分化為某種特異神經(jīng)元以替代損傷神經(jīng)元，有效治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[2-3]，故促進(jìn)內(nèi)源性 NSC增殖與分化有望成為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease， AD)治療的新途徑。本研究擬通過外周少量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSC)，利用腧穴激發(fā)作用和經(jīng)絡(luò)的循經(jīng)作用，誘導(dǎo)癡呆大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性NSC增殖、分化，探討治療AD的新技術(shù)與方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量(210±20)g，由廣州永諾生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào) SCXK(粵)2013-0034。實(shí)驗(yàn)大鼠在自由飲食、溫度 21℃～27℃、正常環(huán)境下飼養(yǎng) 1周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范。

1.2 主要試劑和儀器

Aβ1-42(A118755，阿 拉 丁 );Nestin 抗 體(SC- 23927，Santa cruz);β-Tubulin-Ⅲ(BM3880，博士德生物科技有限公司);MS二抗IgG(Ab150106，Abcam);Rb二抗IgG(AB150074， Abcam);Hoechst 33258(H1399， Invitrogen);SD 大鼠骨髓BMSC細(xì)胞(SCSP-402，上海細(xì)胞庫);雙臂腦立體定位儀(SA-Ⅱ，廣州必特生物科技有限公司);高速顱骨鉆(JC100A，Saeshin);水迷宮(廣州必特生物科技有限公司);全自動(dòng)正立熒光顯微鏡(德國CARL ZEISS)。

1.3 模型制備

從50只大鼠中按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只大鼠作為對照組，剩余 40只大鼠采用Aβ1-42寡聚體側(cè)腦室灌注建立大鼠AD模型[4]。以4%水合氯醛按8 μL/g的劑量腹腔麻醉，動(dòng)物麻醉后固定于腦立體定位儀上。參考Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜，以前囟平面為參考平面，按照海馬CA1區(qū)坐標(biāo)確定進(jìn)針部位，即前囟后3.8 mm(A/P)，中線旁開2.5 mm(L/R)，前囟下3 mm(H)，兩側(cè)各注射溶于PBS的質(zhì)量濃度為4 g/L的Aβ1-42 1 μL，對照組同以上方法在雙側(cè)海馬CA1區(qū)各注射1 μL的生理鹽水。

1.4 分組與干預(yù)

將40只造模成功的AD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法平均分為模型組、風(fēng)府穴組、足三里穴組、尾靜脈組。大鼠 BMSC細(xì)胞復(fù)蘇后，采用 Gibco公司 10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基于5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞，再用培養(yǎng)基終止消化，離心去除培養(yǎng)基，最后將細(xì)胞重懸于PBS溶液中，調(diào)整其密度為2×106個(gè)/mL。風(fēng)府穴組于風(fēng)府穴向后下方斜刺1 mm注入BMSC 1×106個(gè)/500 μL;模型組風(fēng)府穴注入500 μL生理鹽水，足三里穴組隨機(jī)選單側(cè)足三里穴進(jìn)針 3～5 mm注入 BMSC 1×106個(gè)/500 μL;尾靜脈組從尾靜脈注入 BMSC 1×106個(gè)/500 μL;對照組作為空白對照不做處理;大鼠風(fēng)府穴位于枕骨頂脊后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷處;足三里穴位于膝關(guān)節(jié)外側(cè)腓骨小頭下約5 mm處。大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》相關(guān)定位方法[5]。

1.5 樣本采集與處理

各組干預(yù)處理 4周后，采用水迷宮行為學(xué)檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行心臟灌注[6]，開顱進(jìn)行腦組織取材，常規(guī)石蠟包埋切片。免疫熒光檢測Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白在組織切片中的表達(dá)，在全自動(dòng)正立熒光顯微鏡下觀察 Nestin+、β-Tubulin-Ⅲ+細(xì)胞，隨機(jī)拍攝 4個(gè)不重疊的視野，用Image J軟件計(jì)數(shù)4個(gè)視野下陽性細(xì)胞總數(shù)，以平均數(shù)表示其相應(yīng)的陽性細(xì)胞數(shù)[7-8]。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 水迷宮行為學(xué)檢測

水迷宮行為學(xué)檢測包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)，采用大鼠逃避潛伏期(EL值)和120 s內(nèi)穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)作為檢測指標(biāo)，以評價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)將各組受試大鼠按順時(shí)針的順序分別從水池 4個(gè)象限入水點(diǎn)依次放進(jìn)水中，電腦記錄大鼠120 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(即為逃避潛伏期，escape latency， EL)，EL 值記錄單位為(s)。空間探索實(shí)驗(yàn)撤去池中平臺(tái)，再選擇水池第一象限的同一入水點(diǎn)，然后將大鼠面朝水池壁方向放置水中，電腦記錄大鼠120 s內(nèi)穿越虛擬平臺(tái)(即原平臺(tái)位置)次數(shù)，并以此評估大鼠的存儲(chǔ)記憶、提取再現(xiàn)的能力。EL值越大、穿越平臺(tái)次數(shù)越少代表大鼠學(xué)習(xí)記憶能力愈差。大鼠造模4周后，采用Morris水迷宮行為學(xué)測試以評估大鼠AD模型。以對照組大鼠EL的平均值為參考值，計(jì)算每只造模大鼠與參考值之差占該大鼠EL的比值，若該值＞20%則納入模型，并統(tǒng)計(jì)分析對照組與模型EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)，以判定大鼠AD模型構(gòu)建是否成功[9-10]。各組大鼠干預(yù)處理后，再次進(jìn)行水迷宮行為學(xué)檢測。

1.6.2 Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)檢測

將組織切片放置恒溫箱中60℃烘烤20 min后，放置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡 10 min，再將組織切片依次放在無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中各浸泡5 min，PBS洗兩次，每次 5 min。將 0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)用電爐加熱至 95℃左右，放入已水化后的組織切片煮沸10～15 min，待緩沖液冷卻后，將切片取出，用PBS洗3次，每次5 min。滴加5%正常山羊血清，室溫封閉1 h，吸去多余液體。于兩張組織切片上分別滴加 Nestin、β-Tubulin-Ⅲ抗體(濃度分別為 1:200，1:100)，放置冰箱4℃過夜，次日37℃復(fù)溫45 min，PBS洗3次，每次2 min。各張組織切片上分別滴加相對應(yīng)的 Alexa555熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次2 min。在每張切片上滴加50 μL PBS稀釋 1000倍的 Hoechst，染色 10 min，PBS洗 3次每次2 min，中性樹脂封片，待其凝固后拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graghpad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組完全隨機(jī)設(shè)計(jì)計(jì)量資料滿足正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析組間差異，進(jìn)一步組間比較采用Tukey法檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠造模后EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)比較

與正常組比較，模型組EL值顯著增加(P＜0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P＜0.001)。詳見表1。

表1 兩組大鼠造模后EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)比較 (±s)

表1 兩組大鼠造模后EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)比較 (±s)

注:與對照組比較1)P＜0.01

組別 n EL(s) 穿越平臺(tái)次數(shù)(次)對照組 10 26.03±1.32 9.20±1.69模型組 10 48.74±5.801) 3.30±1.341)

2.2 各組大鼠干預(yù)后EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)比較

與模型組比較，大鼠BMSC穴位移植后風(fēng)府穴組的EL值無明顯降低(P＞0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)無明顯增加(P＞0.05);而尾靜脈組的EL值顯著降低(P＜0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P＜0.01)。與對照組比較，尾靜脈組 EL值顯著延長(P＜0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)后EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)比較 (±s)

表2 各組大鼠干預(yù)后EL值、穿越平臺(tái)次數(shù)比較 (±s)

注:與對照組比較 1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.01;與風(fēng)府穴組比較 4)P＜0.05，5)P＜0.01;與足三里組比較6)P＜0.01

組別 n EL(s) 穿越平臺(tái)次數(shù)(次)對照組 10 27.19±2.11 9.50±1.35模型組 10 45.87±1.862) 3.50±1.272)風(fēng)府穴組 10 42.19±1.632) 4.80±1.232)足三里組 10 44.59±4.202) 4.10±1.662)尾靜脈組 10 35.54±1.892)3)4)6) 7.30±2.001)3)5)6)

2.3 各組大鼠干預(yù)后海馬區(qū) Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白的表達(dá)

采用免疫熒光法檢測各組大鼠海馬區(qū) Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白的表達(dá)，評估大鼠BMSC風(fēng)府穴穴位移植干預(yù)治療對 AD大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的影響。與模型組比較，風(fēng)府穴組Nestin細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.05)，尾靜脈組增加(P＜0.01)，足三里組無明顯變化(P＞0.05);與尾靜脈比較，風(fēng)府穴組Nestin+細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05);表明大鼠BMSF風(fēng)府穴穴位移植能促進(jìn)海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖，效果與尾靜脈組相當(dāng)。詳見圖1，表3。

β-Tubulin-Ⅲ蛋白表達(dá)，顯微鏡下細(xì)胞膜或胞質(zhì)顯紅色者為β-Tubulin-Ⅲ+細(xì)胞，見圖 2，細(xì)胞計(jì)數(shù)見表 4。與模型組比較，風(fēng)府穴組β-Tubulin-Ⅲ+細(xì)胞數(shù)無明顯增加(P＞0.05)。

圖1 熒光顯微鏡下各組Nestin+細(xì)胞

圖2 熒光顯微鏡下各組β-Tubulin-Ⅲ+細(xì)胞

表3 各組大鼠干預(yù)后Nestin+細(xì)胞個(gè)數(shù) (±s，個(gè))

表3 各組大鼠干預(yù)后Nestin+細(xì)胞個(gè)數(shù) (±s，個(gè))

注:與模型組比較 1)P＜0.05，2)P＜0.01;與風(fēng)府穴組比較 3)P＜0.01;與足三里組比較4)P＜0.01

組別 n 細(xì)胞個(gè)數(shù)對照組 10 8.00±0.82模型組 10 5.00±1.47風(fēng)府穴組 10 9.13±2.101)足三里組 10 4.75±1.713)尾靜脈組 10 10.50±2.082)4)

表4 各組大鼠干預(yù)后β-Tubulin-Ⅲ+細(xì)胞個(gè)數(shù)(±s，個(gè))

表4 各組大鼠干預(yù)后β-Tubulin-Ⅲ+細(xì)胞個(gè)數(shù)(±s，個(gè))

注:與對照組比較 1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.01

組別 n 細(xì)胞個(gè)數(shù)對照組 10 15.50±2.08模型組 10 5.25±2.222)風(fēng)府穴組 10 8.50±1.292)足三里組 10 7.25±1.502)尾靜脈組 10 11.00±1.831)3)

3 討論

阿爾茨海默病是以海馬神經(jīng)元和突觸的變性、丟失等病理改變?yōu)樘卣鞯囊环N與老化密切相關(guān)的中樞神經(jīng)退行性疾病。該病致死、致殘率高，隨著人口老齡化的加劇，AD的治療已成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題。目前研究證實(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞移植或小分子藥物影響神經(jīng)干細(xì)胞再生可能成為AD治療的新途徑[11]。

3.1 神經(jīng)干細(xì)胞移植與穴位移植

NSC有進(jìn)一步分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能，這與其特性有關(guān)，包括自我更新，NSC具有對稱分裂及不對稱分裂兩種分裂方式，從而保持干細(xì)胞庫穩(wěn)定;多向分化潛能，NSC可以向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化;低免疫源性，NSC是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟的細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識(shí)別;組織融合性好，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活。BMSC同樣具有干細(xì)胞特性，與NSC比較BMSC來源廣泛、便于提取、純化，采用BMSC做為干細(xì)胞移植，更具有可行性[12]。神經(jīng)干細(xì)胞移植開創(chuàng) AD等神經(jīng)變性性疾病治療的新途徑，目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中所使用的干細(xì)胞移植方法主要包括立體定向腦內(nèi)注射移植、脊髓局部注射移植、腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射移植、腦室穿刺注射移植、枕大池穿刺移植、靜脈內(nèi)注射移植和動(dòng)脈內(nèi)注射移植。但每種方法均有優(yōu)、缺點(diǎn)，且多數(shù)方法難以直接應(yīng)用于臨床。例如立體定向腦內(nèi)注射移植、脊髓局部注射移植、腦室穿刺注射移植、枕大池穿刺移植等對神經(jīng)系統(tǒng)損傷太大;腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射移植需透過腦脊液-腦屏障、靜脈內(nèi)注射移植和動(dòng)脈內(nèi)注射移植不僅移程長，還需透過血腦屏障(BBB)，造成移行過程中干細(xì)胞損失太多。所以將外源性神經(jīng)干細(xì)胞直接移植宿主神經(jīng)系統(tǒng)，應(yīng)用于臨床并非易事，而且外源性神經(jīng)干細(xì)胞直接移植宿主有致瘤性。本研究采用穴位移植方法，通過外周少量BMSC刺激作用，利用腧穴激發(fā)作用和經(jīng)絡(luò)循經(jīng)作用，誘導(dǎo)腦內(nèi)內(nèi)源性 NSC增殖，可突破上述神經(jīng)干細(xì)胞移植方法的局限性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí) BMSC通過風(fēng)府穴與尾靜脈移植均能誘導(dǎo)癡呆大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSC增殖。

3.2 阿爾茨海默病與督脈風(fēng)府穴

AD屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”“癲證”“健忘”等范疇。病位在腦，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以腎虛致衰的學(xué)說為最[13]?！端貑枴っ}要精微論》:“頭者，精明之府”;《靈樞·海論》:“腦為髓之海”，腎主骨生髓，所以腦與腎關(guān)系密切;腦為奇恒之府，與奇經(jīng)八脈的氣血功能密切相關(guān)，其中尤以與督脈關(guān)系為最[14]。其次，頭為諸陽之會(huì)，五臟六腑之清陽皆會(huì)聚于腦，而督脈為陽經(jīng)之海，總督諸陽經(jīng)，與腦、脊髓等關(guān)系相當(dāng)密切，故歷代醫(yī)家素有“病變在腦，首取督脈”之說[15]。

經(jīng)絡(luò)學(xué)說認(rèn)為“督脈起于胞中，下出會(huì)陰，后行于腰背正中，循脊柱上行，經(jīng)項(xiàng)部至風(fēng)府穴，進(jìn)入腦內(nèi)……”，《難經(jīng)·二十八難》:“督脈者，上至風(fēng)府，入屬于腦”。說明風(fēng)府穴是督脈經(jīng)氣進(jìn)入腦內(nèi)的“門戶”。風(fēng)府穴在項(xiàng)部，當(dāng)后發(fā)際正中直上1寸，枕外隆凸直下，兩側(cè)斜方肌之間的凹陷中，深面正對延髓，位于頸脊頂部，周圍有神經(jīng)根分布。針刺風(fēng)府穴可“通關(guān)開竅”，具有補(bǔ)髓益精、醒神開竅之功，現(xiàn)代醫(yī)家運(yùn)用毫針、電針、溫針、灸法、穴位注射以及針?biāo)幉⒂玫确椒ㄖ委?AD[16]。風(fēng)府穴也是臨床與動(dòng)物研究常用穴位，目前實(shí)驗(yàn)證實(shí)電針風(fēng)府穴能使AD模型大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)及其受體TrkB與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(GDNF)及其受體 GFR-α1表達(dá)水平增高，提示對膽堿能神經(jīng)元有保護(hù)作用[17]。但風(fēng)府穴在腦內(nèi)內(nèi)源性NSC增殖分化方面的研究尚不深入。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，由于血腦屏障(BBB)的存在，高達(dá)95%的靜脈給藥被阻擋于腦、脊髓之外。但部分腦脊區(qū)缺乏 BBB，與外周神經(jīng)不同，脊神經(jīng)根缺乏神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜，故沒有神經(jīng)束膜屏障功能，從而易受周圍環(huán)境因素變化的影響。風(fēng)府穴周圍即分布有頸脊神經(jīng)根。位于人體正中線上的“無屏障腦區(qū)、嗅黏膜-嗅球-SVZ入腦途徑”是目前發(fā)現(xiàn)的外界物質(zhì)入腦的最直接的解剖學(xué)證據(jù)[18]。這與中醫(yī)學(xué)督脈的經(jīng)絡(luò)循行高度吻合，是督脈入腦的生理學(xué)與解剖學(xué)依據(jù)。選擇督脈風(fēng)府穴進(jìn)行干細(xì)胞穴位移植，產(chǎn)生的局部刺激信息，抑或反應(yīng)物，可能通過“無屏障腦區(qū)、嗅黏膜-嗅球-SVZ入腦途徑”進(jìn)入腦內(nèi)SVZ，誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC增殖。本研究證實(shí) BMSC風(fēng)府穴穴位移植誘導(dǎo)癡呆大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSC增殖作用與尾靜脈移植相當(dāng)。

3.3 阿爾茨海默病與中醫(yī)刺灸療法

AD是一個(gè)多病因的神經(jīng)退行性疾病，炎癥與氧化應(yīng)激、代謝障礙、鈣離子通道受損、線粒體障礙、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等都與 AD的發(fā)生密切相關(guān)[19]。中醫(yī)刺灸療法可通過多途徑、多靶點(diǎn)改善 AD動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力[20]。艾灸可改善小鼠的記憶學(xué)習(xí)能力，其機(jī)制可能與減少大腦額葉皮層及海馬區(qū)的 Aβ沉積有關(guān)[21]。針刺可調(diào)控p38 MAPK通路，降低AD大鼠海馬區(qū)磷酸化Tau蛋白的表達(dá)[22]。電針可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)中樞神經(jīng)傳遞、調(diào)節(jié)能量代謝等[23-24]。穴位注射具備藥物和針刺的雙重功效，在治療阿爾茨海默病方面仍需要進(jìn)一步探究[25]。本項(xiàng)目采用生理鹽水風(fēng)府穴穴位注射，從內(nèi)源性 NSC增殖角度與對照組沒有明顯區(qū)別，但不能證實(shí)穴位注射療法沒有其他作用。

3.4 神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞定向分化

學(xué)習(xí)記憶是一個(gè)復(fù)雜的過程，突觸改變是水迷宮記憶形成的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[26]，移植的神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞，整合進(jìn)入宿主的腦組織，或分泌神經(jīng)遞質(zhì)促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)才能產(chǎn)生有益效果。而神經(jīng)干細(xì)胞定向分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，且神經(jīng)干細(xì)胞增殖不一定與成熟神經(jīng)細(xì)胞分化同步。研究發(fā)現(xiàn)AD患者海馬區(qū)NSCs的數(shù)量和未成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白表達(dá)增加，但成熟神經(jīng)元標(biāo)志蛋白沒有增加[27]。成熟的神經(jīng)元減少，不能完成相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙。移植的NSCs能夠分化成熟神經(jīng)細(xì)胞，但分化速度緩慢，且NSCs的分化與腦內(nèi)微環(huán)境有關(guān)[28]。與上述研究結(jié)論相類似，本研究 AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，風(fēng)府穴組改善不明顯，不及尾靜脈組，可能與其促進(jìn)增殖的內(nèi)源性NSC向成熟神經(jīng)細(xì)胞分化不明顯有關(guān)。尾靜脈組因BMSC直接注入血液，有可能改善了NSCs分化的腦內(nèi)微環(huán)境，故其成熟細(xì)胞分化明顯。這就提示BMSC穴位移植聯(lián)合神經(jīng)生長因子可能會(huì)改善NSCs向成熟神經(jīng)細(xì)胞的定向分化。而 BMSC風(fēng)府穴穴位移植誘導(dǎo)癡呆大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSC增殖的分子機(jī)制與調(diào)控機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。