匡洪影，張麗，李威，張益蒴，馮文婷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040;3.長春科技學(xué)院，長春 130000;4.山西省太原市第三人民醫(yī)院，太原 030000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性常見的代謝性疾病之一，在臨床上以雄激素過高、肥胖、持續(xù)無排卵、卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣?，常伴有體質(zhì)量指數(shù)(BMI)的異常。據(jù)統(tǒng)計PCOS患者中發(fā)生肥胖的概率為30%～50%，且肥胖與PCOS的臨床表型之間關(guān)系密切[1]。脂肪細(xì)胞能夠分泌具有生物活性的瘦素、脂聯(lián)素及與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子。脂肪因子分泌異?？赡苁菍?dǎo)致PCOS發(fā)生的機制之一。PCOS患者體內(nèi)脂肪組織的異常蓄積可能引起脂肪因子分泌紊亂，進(jìn)而可能影響患者的生殖功能的調(diào)控。研究表明，通過改善生活方式，降低體質(zhì)量可以改善PCOS患者的排卵障礙[2]，提示降低 PCOS體內(nèi)脂肪蓄積量及改善脂肪組織的內(nèi)分泌水平可能對緩解 PCOS的臨床表征有積極的作用。有研究表明，針刺可以減輕PCOS患者的體質(zhì)量，改善PCOS患者的癥狀[3]，但針刺的機制卻未明確闡明。本文擬通過觀察針刺對PCOS大鼠脂肪組織代謝因子表達(dá)的影響，探索其治療PCOS的內(nèi)在可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雌性23日齡SD大鼠35只，體質(zhì)量為(50±5)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證號[SCXK(黑)2013-001]。以溫度 21℃～23℃，相對濕度42%～56%，照明 12 h晝夜交替環(huán)境下飼養(yǎng)，動物自由攝取食物和水，隔日換墊料，清理籠具。實驗過程中對大鼠的操作均按照黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物使用與倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，符合動物福利的基本原則、3R原則等相關(guān)的要求。

1.2 主要試劑與儀器

注射用大豆油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone， DHEA)(北京百靈威科技有限公司)，0.9%氯化鈉注射液(四川沱牌藥業(yè)有限責(zé)任公司)，75%醫(yī)用乙醇(德州樂康消毒制品有限公司)，華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，0.30 mm×25 mm一次性針灸針(貴州安迪有限公司)，顯微鏡(日本 OLYMPUS BX 60)，血清 FSH檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，CAT:CEA830Ra)，血清 LH檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司， CAT:CEA441Ra)，血清高密度脂蛋白檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，CAT:SEB006Ra)，血清低密度脂蛋白檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司， CAT:SEB107Ra)，血清膽固醇檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，CAT:CEB701Ge)，血清甘油三酯檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，CAT:CEB687Ge)。

1.3 造模方法

空白組每日給予0.2 mL注射用大豆油頸背部皮下注射;模型組和針刺組均給予99.99%DHEA以6.0 mg/100 g的劑量溶于0.2 mL注射用大豆油中，頸背部皮下注射，連續(xù)注射21 d[4]。各組造模開始8 d后于每日8:00進(jìn)行連續(xù)陰道涂片，經(jīng)亞甲藍(lán)染色后觀察大鼠的動情周期變化[5]。注射DHEA的大鼠陰道上皮細(xì)胞持續(xù)10 d為角化狀態(tài)為動情周期紊亂，造模第21 d處死預(yù)先準(zhǔn)備的模型評估大鼠 3只(每組 1只)進(jìn)行卵巢 HE染色，大鼠動情周期紊亂并且卵巢呈多囊狀態(tài)表示造模成功。本實驗大鼠全部造模成功。

1.4 動物分組與處理

將35只大鼠隨機分為空白組9只、模型組9只、針刺組9只和空白針刺組8只?？瞻揍槾探M為研究大鼠不同部位脂肪因子mRNA的差異性表達(dá)而特設(shè)，只作為比較研究，飼養(yǎng)方法與空白組相同，與針刺組同等時間進(jìn)行針刺干預(yù)。針刺組大鼠造模成功后開始針刺干預(yù)。取穴為關(guān)元(腹部前正中線，臍下約25 mm處)、中極(腹部前正中線，臍下約35 mm處)、子宮(中極旁開約25 mm處)和三陰交(后肢內(nèi)踩尖直上10 mm處)，腧穴定位參照全國協(xié)編教材《實驗針灸學(xué)》[6]中大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜以及動物與人解剖定位。電針選擇低頻連續(xù)波，頻率為2 Hz，強度以針刺穴位微微顫動為度[7]。每日1次，每周5 d。第1周每次15 min，第2、3周每次20 min，第4、5周每次25 min，連續(xù)5周電針刺激干預(yù)?？瞻捉M和模型組不給予任何干預(yù)，僅給予與其他組同等條件下抓取刺激。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 實驗動物體質(zhì)量變化曲線和動情周期

各組大鼠造模開始后每日 7:30觀察大鼠生命體征及活動度，進(jìn)行稱重并記錄體質(zhì)量。各組大鼠造模開始8 d后于每日8:00進(jìn)行連續(xù)陰道涂片，通過觀察陰道脫落細(xì)胞形態(tài)的方法確定大鼠動情周期。

1.5.2 血清激素水平檢測

在鏡下觀察空白組、針刺組陰道涂片進(jìn)入動情周期的動情期后，禁食12 h后眼眶取血，將血放置1 h，3500 rpm離心15 min后分離血清，留取上清液并放置﹣70℃冰箱保存。卵泡刺激素(FSH)、黃體生成激素(LH)的測定由武漢云克隆科技股份有限公司檢測中心采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，脂代謝相關(guān)高密度脂蛋白膽固醇(HLD-C)、低密度脂蛋白 (LDL)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CH)的測定由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科生化組采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，具體操作步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。具體操作步驟為，加樣(標(biāo)準(zhǔn)品及樣本)50 μL后，立即加入檢測溶液 A50 μL，37℃孵育 1 h;甩干，洗板 3次;加檢測溶液 B100 μL，37℃孵育30 min;洗板5次后加TMB底物90 μL，37℃孵育10～20 min;最后加終止液50 μL，立即450 nm讀數(shù)。

1.5.3 脂肪組織的取材保存和卵巢組織HE染色

針刺組處死前針刺1 h，各組大鼠分離血清后用頸椎脫臼法處死大鼠。取腹股溝脂肪、腹部皮下脂肪、腹部脂肪、子宮旁脂肪、性腺旁脂肪、腸系膜脂肪，稱量各個組織重量后保存于﹣70℃冰箱以備后續(xù)實驗使用;取大鼠一側(cè)卵巢用 10%中性福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋并切片后，使用蘇木素-伊紅染色液對切片進(jìn)行HE染色。在顯微鏡鏡下觀察卵巢切片形態(tài)變化，并留取圖片。

1.5.4 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠不同部位脂肪瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、孤兒核受體Nr4a2(Nr4a2)、孤兒核受體Nr4a3(Nr4a3)的表達(dá)。根據(jù)試劑盒說明書[thermo scientific BR green qpcr master mix(2x) ROX solution]要求進(jìn)行操作，提取組織總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)體系為25 mL，分別加入10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mM) 2 μL、Mg2+1.5 μL、上游引物(50 mM)0.5 μL、下游引物(50 mM) 0.5 μL、cDNA 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、DEPC水17 μL。反應(yīng)溫度為，預(yù)變性，95℃ 5 min;變性，95℃ 30 s;60℃退火;延伸，72℃，30 s;重復(fù)變性、退火、延伸，共35個循環(huán)，充分延伸，72℃，10 min，結(jié)束溫度為 4℃。所得 CT 值，采用 2﹣ΔΔCT法進(jìn)行計算。參照NCBI基因庫的基因序列來設(shè)計引物，該實驗擴(kuò)增片段長度為100～300 bp。具體如下。

表1 引物序列

為明確電針對模型動物的療效作用，空白針刺組大鼠與針刺組大鼠同時接受相同劑量及頻率的電針刺激。在電針刺激結(jié)束后檢測各部位脂肪組織細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，分別計算正常大鼠及模型大鼠各部位脂肪因子在接受針刺動物及未接受針刺動物中表達(dá)水平的比率變化，采用 R軟件對基因表達(dá)水平進(jìn)行heatmap分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性后用單因素方差分析(One-way ANOVA)法比較，方差齊者用Bonferroni(B)檢驗，方差不齊者用Dunnett's T3(3)檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCOS模型動物鑒定及電針的療效評估

由圖1A可見，3組大鼠在實驗期間的體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。由圖1B可見，模型組相比空白組動情周期時間明顯延長(P＜0.05);針刺組與模型組比較，動情周期時間縮短(P＜0.05)。由圖 1C可見，空白組卵巢HE染色可見各個時期的卵泡且形狀規(guī)則，部分卵泡可見增大的卵泡腔和呈丘狀突出于卵泡腔的卵丘，緊密排列的顆粒細(xì)胞可達(dá) 8～9層，排卵后的黃體黃素化明顯，間質(zhì)與卵泡內(nèi)膜界限相對于模型組來說較為清晰，以上均提示空白組大鼠有規(guī)律排卵。模型組可見大小不等的未成熟卵泡，囊狀卵泡多且形狀不規(guī)則，部分卵泡可見退行性閉鎖，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少至2～3層，黃體少見，且組織間界限不是很清晰。針刺組可見單個成熟卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)較模型組多，3～5層，組織界限較模型組清晰。

2.2 實驗動物體質(zhì)量及不同部位脂肪組織重量差異

由圖2A可見，針刺組與空白組、模型組比較，體質(zhì)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由圖 2B可見，針刺組腹股溝脂肪、腹部皮下、子宮旁、性腺旁、腸系膜脂肪濕重較空白組明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，模型組腹股溝脂肪濕重較針刺組明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠血脂、血清性激素水平變化

由圖3A可見，模型組HLD-C、TG、CH、LDL較空白組、針刺組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由圖3B可見，針刺組血清FSH較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由圖3C可見，模型組LH/FSH比值較空白組升高，針刺組較模型組下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 不同組別不同部位脂肪因子mRNA表達(dá)水平

由圖4可見，與空白組比較，模型組的脂聯(lián)素mRNA在腸系膜脂肪，Nr4a2 mRNA在性腺旁、腸系膜脂肪表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Nr4a2 mRNA在子宮旁脂肪，Nr4a3 mRNA在腹部皮下脂肪、腹部脂肪表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，針刺組的瘦素 mRNA在腸系膜脂肪、Nr4a2和Nr4a3 mRNA在子宮旁脂肪表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，脂聯(lián)素 mRNA在腹部脂肪表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 DHEA對大鼠卵巢機能的影響及電針的作用評估(HE染色，×100)

圖2 實驗動物體質(zhì)量及不同部位脂肪重量統(tǒng)計

圖3 大鼠血脂及血清性激素水平比較

圖4 不同組別不同部位脂肪因子的表達(dá)水平比較

2.5 各組不同部位脂肪因子針刺前后表達(dá)水平比率

由圖5可見，不同脂肪因子在空白針刺組/空白組和針刺組/模型組大鼠不同部位表達(dá)水平不同，左側(cè) 4組(紅色)為正常大鼠針刺后不同部位脂肪組織因子表達(dá)的變化，右側(cè)4組(綠色)為PCOS模型大鼠針刺后不同部位脂肪組織因子表達(dá)的差異，針刺改變了模型組大鼠不同部位脂肪因子的表達(dá)水平，PCOS模型大鼠針刺后全身脂肪因子的變化模式與正常大鼠接受針刺后脂肪因子的變化模式相比存在明顯的差異。

圖5 各組不同部位脂肪因子針刺后表達(dá)水平比率熱圖

3 討論

多囊卵巢綜合征是育齡期女性常見的疾病，發(fā)病率逐年升高，PCOS患者多伴有肥胖的發(fā)生，PCOS癥狀與體質(zhì)量指數(shù)的增加密切相關(guān)[1]。針刺是中醫(yī)治療中常用的能夠減輕肥胖患者的體質(zhì)量的有效治療方式，同時針刺也對PCOS患者的臨床癥狀有治療作用。有研究表明，針刺對肥胖患者的血脂水平，胰島素抵抗程度，脂肪累積程度均能起到改善作用[8-9]。

脂代謝異?？赡苁?PCOS患者體內(nèi)最常見的代謝紊亂，主要表現(xiàn)為TG、LDL的升高及HDL的降低[10]。相關(guān)實驗表明，PCOS大鼠HDL、LDL、TG、CH均升高，針刺后均下降，這可能與體內(nèi)脂肪組織異常分泌脂肪因子，內(nèi)臟脂肪的異位沉積等有關(guān);針刺可能抑制食欲，改善胰島素抵抗，加快脂肪的分解和能量的代謝[11]，達(dá)到改善 PCOS癥狀的作用。研究表明，PCOS患者的 LH分泌增加、FSH分泌減少，與體內(nèi)胰島素共同作用合成雄激素，使胰島素分泌增加，形成惡性循環(huán)，從而加重PCOS病情[12]。實驗結(jié)果表明針刺可能通過改善 PCOS整體情況而調(diào)節(jié)FSH和LH的分泌。

脂肪組織分泌的脂肪細(xì)胞因子過多可引起糖脂代謝紊亂和PCOS，從而導(dǎo)致不孕[13]。有研究表明，在PCOS患者中肥胖與胰島素抵抗可能相互促進(jìn)，加重PCOS癥狀[14]。大約80%的PCOS婦女和95%的肥胖婦女檢測到胰島素抵抗，高胰島素血癥和胰島素抵抗可能與瘦素、脂聯(lián)素有關(guān)[15]。瘦素受體在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)與糖皮質(zhì)激素協(xié)同作用促進(jìn)類固醇生成，瘦素通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦受體葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌[16]。脂聯(lián)素的主要作用在于胰島素的上調(diào)和能量平衡，可以增強胰島素分泌，抑制肝細(xì)胞的糖異生[17]。高胰島素血癥可能通過引起顆粒細(xì)胞過早成熟，抑制顆粒細(xì)胞增殖和 LH水平升高的發(fā)展而導(dǎo)致無排卵[18]。瘦素在高瘦素血癥等條件下的負(fù)面影響是抑制卵巢對促性腺激素刺激的反應(yīng)，可能在PCOS的發(fā)展中起作用[19]。更有研究表明瘦素抑制卵泡，影響胚胎植入和子宮內(nèi)膜容受，從而影響生殖功能[20]。脂聯(lián)素已被證明在體外可抑制雄激素的產(chǎn)生和卵泡細(xì)胞的LH受體基因的表達(dá)[21]。脂聯(lián)素可能在卵母細(xì)胞成熟，顆粒細(xì)胞增殖和死亡以及雌二醇和孕酮的產(chǎn)生中發(fā)揮作用[22]。Nr4a受體在糖脂代謝中起到重要作用。在禁食和胰高血糖素刺激下或糖尿病出現(xiàn)病理性糖異生時，肝臟的Nr4a受體增加[23]。在肌肉細(xì)胞中敲降Nr4a3基因，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、丙酮酸使用的基因顯著衰減，氧化代謝減慢[24]。Nr4a3可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，增強胰島素信號，研究發(fā)現(xiàn)Nr4a受體的過量表達(dá)顯著加快脂肪細(xì)胞的分解[25]。肥胖型PCOS患者發(fā)生不孕幾率顯著高于正常人群，其病理機制可能與上述脂肪因子的表達(dá)水平異常有關(guān)。針刺可以減輕體質(zhì)量，改善 PCOS癥狀，因此推測對 PCOS患者的針刺治療可能改善患者不孕的情況。

脂肪作為全身最大的內(nèi)分泌器官，在調(diào)節(jié)機體代謝、生殖、心血管功能和免疫方面通過分泌脂肪細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)因子以自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的模式發(fā)揮作用。肥胖者下丘腦瘦素受體對瘦素的敏感性下降，負(fù)反饋導(dǎo)致瘦素分泌增加，產(chǎn)生瘦素抵抗，使瘦素對胰島素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制受到破壞，進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗[26]。有研究表明PCOS大鼠脂聯(lián)素水平明顯降低，瘦素水平明顯升高，與機體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相符[27]。本研究通過瘦素在3組大鼠不同部位脂肪因子表達(dá)水平的研究，發(fā)現(xiàn)瘦素在PCOS大鼠不同部位變化趨勢不一致且變化不明顯，但電針可以明顯升高瘦素在腸系膜脂肪上的表達(dá)。脂聯(lián)素是脂肪組織與機體代謝的紐帶，與體脂含量呈負(fù)相關(guān)。功能主要有刺激脂肪代謝、抑制脂肪合成，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素[28]。研究表明，脂聯(lián)素水平在PCOS患者較正常者低[29]。Artimani T等[30]研究表明 PCOS女性卵巢顆粒細(xì)胞中脂聯(lián)素和受體減少，并且卵巢過度刺激后高分子量脂聯(lián)素也減少。脂肪組織增多導(dǎo)致脂聯(lián)素基因表達(dá)降低，導(dǎo)致脂代謝紊亂，增加胰島素抵抗的發(fā)生風(fēng)險，加重PCOS癥狀[31]。本實驗結(jié)果表明針刺前脂聯(lián)素 mRNA的表達(dá)水平在PCOS大鼠腸系膜脂肪中明顯降低，電針刺激后明顯降低了其在腹部脂肪的表達(dá)，由此推測PCOS的癥狀可能主要與脂聯(lián)素在腸系膜脂肪表達(dá)水平的降低有明顯關(guān)系，而與其他部位脂聯(lián)素表達(dá)的關(guān)系不顯著。有研究揭示了一系列由 Nr4a亞家族成員的功能，包括一般代謝、免疫、細(xì)胞應(yīng)激、記憶、胰島素敏感性和心臟穩(wěn)態(tài)，通過調(diào)節(jié)其產(chǎn)物參與這些過程的特定靶基因。這些受體在各種疾病如癌癥、炎癥、動脈粥樣硬化和肥胖癥的發(fā)病和進(jìn)展中起作用[32]。本實驗結(jié)果表明，電針治療PCOS大鼠后Nr4a2和Nr4a3 mRNA在子宮旁脂肪的表達(dá)明顯上升。因此可以推測電針刺激后Nr4a亞家族成員在子宮旁脂肪對糖脂的攝取利用明顯增加，脂肪因子Nr4a2和Nr4a3可能主要通過旁分泌作用來改變局部糖脂代謝并改善癥狀。

盡管針刺已經(jīng)是國際認(rèn)可的一種治療疾病的有效手段，但有關(guān)針刺科學(xué)性的爭論卻一直沒有停止[33]。如果針刺僅僅是一種簡單的物理刺激，那么正常大鼠及PCOS模型大鼠在獲得針刺刺激后，不同部位脂肪組織關(guān)鍵因子表達(dá)的變化趨勢應(yīng)該相同或相近。通過熱圖可以明顯看出，空白針刺組/空白組和針刺組/模型組大鼠不同部位不同因子表達(dá)水平明顯不同而且同一因子在同一部位正常和 PCOS狀態(tài)下對電針治療的表達(dá)不同。這些結(jié)果表明針刺不是單純的物理刺激而是一種有潛在治療機制的有效療法。電針對PCOS模型動物異常表型的療效機制可能涉及體內(nèi)多種因子表達(dá)和信號通路傳導(dǎo)的改變。

通過熱圖發(fā)現(xiàn)同一個因子在接受針刺后的表達(dá)趨勢和變化程度并不完全一致，同一部位脂肪組織在接受針刺后脂肪因子的表達(dá)量和變化水平也是不同的，針刺后的反應(yīng)性與因子的表達(dá)程度有差異。這可能與針刺作用靶點不同、與脂肪組織的類型不同有關(guān)，不同部位的脂肪組織對于針刺的反應(yīng)性存在差異。這說明了針刺的作用靶點可能是某一部位脂肪的某個因子，針刺對于全身機能調(diào)節(jié)的機制并不是說所有脂肪組織當(dāng)中變化趨勢都一致，而是存在著部位的差異性，在今后還要繼續(xù)對針刺的作用機制進(jìn)行研究。

綜上所述，針刺調(diào)節(jié)PCOS模型大鼠脂肪的機制主要是通過腸系膜脂肪的瘦素、腹部脂肪的脂聯(lián)素和子宮旁脂肪的Nr4a2、Nr4a3發(fā)揮作用，針刺后脂肪因子在全身不同部位脂肪的表達(dá)水平有差異性，脂肪作為一個內(nèi)分泌器官通過瘦素和脂聯(lián)素影響 PCOS患者的生殖情況。