汪宏才 汪輝 王紅琳

摘要：為保證傳染性支氣管炎抗原的質(zhì)量，測(cè)定了3種不同來(lái)源的傳染性支氣管炎病毒株的EID50，選取滴度最高的病毒株作為毒種，建立了傳染性支氣管炎病毒W(wǎng)H株種子批，并對(duì)凍干毒種進(jìn)行了毒價(jià)測(cè)定。結(jié)果表明， 含毒尿囊液在凍干前后毒價(jià)無(wú)顯著性差異，毒種的EID50在10代內(nèi)無(wú)變化。凍干毒種在-40 ℃和-15 ℃保存1年，其毒價(jià)基本不變。經(jīng)檢驗(yàn)種子批未受到細(xì)菌及其他微生物的污染。

關(guān)鍵詞：傳染性支氣管炎;WH株;種子批

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.5 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）10-0120-003

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.028 ? ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： In order to ensure the quality of infectious bronchitis antigen， the EID50 of infectious bronchitis virus strains from three sources were determined and the virus strains with high titer as virus species were selected， and the seed batch of infectious bronchitis virus WH strain were established. The poison value of freeze-dried seed poison was determined. The results showed that there was no significant difference in the poison value of toxic allantoic fluid before and after freeze-drying， and the EID50 of the virus had no change within 10 generations. The poison value of freeze-dried seed poison remained basically unchanged when it was stored at -40 ℃ and -15 ℃ for one year. The seed batch was not contaminated by bacteria and other microorganisms.

Key words： infectious bronchitis; WH strain; seed batch

雞新城疫（Newcastle Disease， ND）和雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis， IB）是影響地方雞的兩種主要病毒性疾病[1]，造成雛雞成活率、成雞產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降。為降低ND、IB對(duì)中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的影響，減少免疫次數(shù)，降低免疫成本，開(kāi)展雞ND、IB二聯(lián)活疫苗的研制。ND采用耐熱無(wú)毒的HB92株，該毒株具有免疫雞能將疫苗毒傳給同群非免疫雞的自然傳播性等特性[2]。禽傳染性支氣管炎病毒W(wǎng)H株是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所自行分離的IBV毒株。進(jìn)化分析表明，該毒株與M41株、H120株以及H52株屬于同一分支，因此也屬于Massachusetts型。為建立雞傳染性支氣管炎WH株種子批系統(tǒng)，按照2015版《中國(guó)獸藥典》的相關(guān)規(guī)定，結(jié)合IB最新研究進(jìn)展和方法，對(duì)毒種的含量、毒力、安全、效力檢驗(yàn)與無(wú)菌檢驗(yàn)等進(jìn)行了試驗(yàn)，為生產(chǎn)合格的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 主要材料 ?IBV毒種1號(hào)為凍干毒， EID50為10-7.1/0.1 mL;2號(hào)為SPF雞胚尿囊液毒，EID50為 ?10-6.9/0.1 mL;3號(hào)為氣管、腎臟混合組織毒，未進(jìn)行EID50的測(cè)定。1～3號(hào)毒種全部置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。SPF雞胚購(gòu)于北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)用雛雞是使用SPF種蛋自行孵化，并在禽用隔離器中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 ?檢驗(yàn)培養(yǎng)基購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司，禽白血病檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。毒種凍干使用美國(guó)LABCONCO凍干機(jī)，ELISA檢測(cè)使用Thermo MK3酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 IBV毒種預(yù)處理 ?1號(hào)毒種加入適量無(wú)菌PBS溶液進(jìn)行復(fù)原。2號(hào)毒種為尿囊液毒種，解凍后直接使用。3號(hào)毒種是組織毒，將混合組織剪碎后，置于2 mL無(wú)菌EP管中，加入適量PBS溶液進(jìn)行組織搗碎，3 000 r/min離心10 min后取上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.2 IBV WH株EID50測(cè)定 ?參考文獻(xiàn)[3]，分別將3種經(jīng)過(guò)預(yù)處理的毒種，用無(wú)菌PBS溶液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)謩e吸取10-5、10-6、10-7、10-8 4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別尿囊腔接種9～11 d SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL置于孵化器中，37 ℃進(jìn)行孵化，記錄其雞胚死亡情況，24 h內(nèi)死亡雞胚不計(jì)，144 h內(nèi)死亡的雞胚隨時(shí)取出，置于4 ℃保存。至144 h取出所有胚，解剖未死亡雞胚，觀察致侏儒情況，統(tǒng)計(jì)后計(jì)算EID50，將EID50最大的毒株作為建立種子批的毒種。

1.2.3 IBV WH株種子批凍干 ?將EID50最大毒株用無(wú)菌PBS溶液進(jìn)行10-2稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N9～10日齡SPF雞胚15枚，0.1 mL/胚，棄去24 h內(nèi)死胚，收獲32～36 h SPF雞胚尿囊液，加入適量蔗糖牛奶作為凍干保護(hù)劑，按一定比例混勻后進(jìn)行冷凍干燥。

1.2.4 凍干品EID50的測(cè)定 ?將凍干后的WH株，隨機(jī)抽取3瓶，分別加入適量PBS溶液復(fù)原，然后按照“1.2.2”的方法測(cè)定EID50。

1.2.5 安全性檢測(cè) ?將凍干品隨機(jī)抽取1瓶，用生理鹽水稀釋至105.0EID50。選取1日齡、30日齡、60日齡的健康易感雞各10只， 分別滴鼻1滴（約0.03 mL），檢驗(yàn)毒株對(duì)不同日齡SPF雞的安全性。試驗(yàn)雞應(yīng)全部健康，無(wú)呼吸異常及神經(jīng)癥狀。

1.2.6 特異性檢驗(yàn) ?根據(jù)凍干后病毒含量的測(cè)定結(jié)果，用生理鹽水稀釋至10-3.5EID50/0.1 mL，與等量抗IBV特異性血清混和均勻，在室溫下作用1 h后，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0.2 mL。置于37 ℃下觀察24～144 h，應(yīng)不引起特異性死亡及雞胚病變，至少有8個(gè)以上雞胚健活。

1.2.7 保存期試驗(yàn) ?將WH株凍干品隨機(jī)抽取若干支，分成兩組，分別置于-40、-15 ℃冰箱保存180、365 d，分別測(cè)定其EID50。

1.2.8 毒種純凈性檢驗(yàn) ?按《中國(guó)獸藥典》[4]2015版附錄的規(guī)定，對(duì)種子批進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)合分子生物學(xué)方法，進(jìn)行支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)[5-7]。

1.2.9 毒種的傳代 ?將WH株凍干毒，用無(wú)菌PBS溶液復(fù)原后，按10-2進(jìn)行稀釋后，接種10日齡SPF雞胚3枚，置于37 ℃進(jìn)行孵化，棄去24 h死亡雞胚，收獲36 h尿囊液，置于-80 ℃凍存。按該法進(jìn)行傳代至15代，分別抽取5、10、15代，按“1.2.2”進(jìn)行病毒含量測(cè)定，選取病毒含量大于10-7.0EID50/0.1 mL的病毒代次作為最高代次。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV WH株的EID50測(cè)定結(jié)果

根據(jù)病毒含量的測(cè)定結(jié)果（表1）， 1～3號(hào)IBV毒株的EID50分別為10-7.5/0.1 mL、10-7.1/0.1 mL和 ?10-6.9/0.1 mL，1號(hào)毒株的病毒含量最高，因此選用1號(hào)毒種作為種子批的毒株。

2.2 ?IBV WH株種子批的凍干

將1號(hào)毒種接種SPF雞胚后，無(wú)菌收獲尿囊液，加入蔗糖牛奶保護(hù)劑后，分裝于西林瓶中進(jìn)行真空干燥，2 mL/瓶，按照2015版《中國(guó)獸藥典》附錄中物理性狀檢驗(yàn)要求，凍干完成后進(jìn)行物理性狀、 真空度、 剩余水分等項(xiàng)目檢測(cè)， 結(jié)果符合要求（表2）。

2.3 凍干品病毒含量的測(cè)定

凍干后IBV WH株隨機(jī)抽檢3瓶進(jìn)行病毒含量的測(cè)定，結(jié)果分別為10-7.3EID50/0.1 mL、10-7.5EID50/0.1 mL和10-7.5EID50/0.1 mL，經(jīng)t檢驗(yàn)，與凍干前病毒含量（10-7.5EID50/0.1 mL）相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.4 凍干品的安全性檢驗(yàn)

3組試驗(yàn)組觀察至14 d，全部表現(xiàn)正常，無(wú)明顯臨床反應(yīng)，結(jié)果符合要求（表3）。

2.5特異性試驗(yàn)

觀察至144 h，10枚SPF雞胚未出現(xiàn)死亡。解剖發(fā)現(xiàn)雞胚大小正常，無(wú)侏儒胚、無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

2.6 保存期試驗(yàn)

將WH株凍干品分別置于-40 ℃和-15 ℃保存180 d和365 d，其病毒含量無(wú)明顯變化（表4）。

2.7 毒種純凈性檢驗(yàn)

毒種接種TG、TSB培養(yǎng)基，觀察7 d，均無(wú)細(xì)菌、無(wú)霉菌生長(zhǎng)，結(jié)果合格（表5）。接種支原體培養(yǎng)基，移植3代后WH株凍干毒均呈陰性（表6）。新城疫病毒、禽白血病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織綜合癥病毒檢測(cè)結(jié)果也均為陰性（表7）。

2.8 ?毒種傳代情況

IBV WH株凍干毒經(jīng)SPF雞胚傳代后， 測(cè)定第5代、第10代和第15代毒種的病毒含量分別為10-7.5EID50/0.1 mL、10-7.3EID50/0.1 mL和10-6.9EID50/0.1 mL（表8），選取大于10-7.0EID50/0.1 mL的代次作為最高代次，因此將毒種傳代次數(shù)限制在10代以內(nèi)。

3 ?結(jié)論

通過(guò)對(duì)3種雞傳染性支氣管炎病毒株的毒力檢測(cè)，篩選出1株滴度高、毒力穩(wěn)定、安全性好的WH株。對(duì)凍干種子批進(jìn)行了檢測(cè)，各項(xiàng)指標(biāo)符合《中國(guó)獸藥典》的要求，可以作為雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗生產(chǎn)的種子批。

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