王倩倩 秦衛(wèi)紅 陳大偉

摘要：旨在探討游離棉酚引起的蛋雞肝臟脂質(zhì)過氧化與脂肪沉積的關(guān)系，試驗(yàn)將360只42周齡京粉2號(hào)商品代蛋雞隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（C組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，3個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加醋酸棉酚100 mg/kg（L組）、200 mg/kg（M組）、400 mg/kg（H組），喂飼42 d后，測(cè)定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量，屠宰后測(cè)定肝臟脂肪酸含量和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，制備病理切片和超薄切片。結(jié)果表明，醋酸棉酚導(dǎo)致血清中AST、ALT升高，呈現(xiàn)時(shí)間與劑量效應(yīng)。試驗(yàn)第4周、第6周時(shí)，M、H組血清中TG和LDL-C極顯著升高（P<0.01），H組血清中CHOL和HDL-C顯著升高（P<0.05）;病理切片觀察發(fā)現(xiàn)棉酚導(dǎo)致蛋雞肝臟脂肪變性，并且呈一定的劑量效應(yīng)。在肝臟脂肪酸中，醋酸棉酚使不飽和脂肪酸組成降低，飽和脂肪酸比例升高。試驗(yàn)組肝臟SOD、GSH-Px活性、GSH含量顯著降低（P<0.05），MDA顯著升高（P<0.05）。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)棉酚對(duì)蛋雞肝臟細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)造成損傷。

關(guān)鍵詞：醋酸棉酚;蛋雞;肝臟;脂肪酸

中圖分類號(hào)：F592.99 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）10-0116-004

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.027 ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： This research was conducted to investigate the effects of free gossypol on fatty acid in liver， lipid peroxidation index and serum index of laying hens. A total of 360 healthy 42-week-old Beijing pink 2 laying hens were randomly divided into 4 groups with 3 replicates per group and 30 hens per replicates. Laying hens in 4 groups fed the basal diet supplemented with gossypol acetate 100 mg/kg （group L）， 200 mg/kg （group M）， 400 mg/kg （group H） and 0 mg/kg （group C）. The experiment lasted for 42 days. TG， CHOL， AST， ALT， LDL-C and HDL-C were determined with biochemical analyzer. At the end of the test， laying hens were executed with bleeding， the livers were collected to determine the fatty acids and lipid peroxidation， also pathological and ultrastructure observation. The results showed that the activity of AST， ALT increased with exposed to Gossypol acetate， showing the time and dose effect. At the 4th and 6th week， TG and LDL-C have increased very significantly （P<0.01）， TC and HDL-C also increased significantly（P<0.05）. Gossypol acetate decreased the unsaturated fatty acid composition and increased the saturated fatty acid proportion in liver. Liver lipid peroxidation index SOD， GSH-Px and GSH decreased significantly（P<0.05） and MDA increased significantly（P<0.05）. Gossypol acetate caused laying hens hepatic steatosis， and showed a dose effect. Gossypol acetate caused structural damage of mitochondria in liver of laying hens. In conclusion， gossypol acetate caused the oxidative stress damage in hepatocyte， further caused the structure and function damage of mitochondrial which played an important role in fat depositing in liver of laying hens.

Key words： gossypol acetate;laying hens;liver;fatty acid

棉酚又稱棉子醇、棉毒素，是一種黃色多酚類物質(zhì)，多以雙醛式存在于錦葵科植物的器官中[1]。中國(guó)棉子粕資源豐富，2014年棉花產(chǎn)量為618萬(wàn)t[2]， 棉子粕產(chǎn)量可達(dá)500萬(wàn)t。但由于游離棉酚、環(huán)丙烯脂肪等抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在大大限制了棉子粕的使用。艾曉杰[3]研究發(fā)現(xiàn)， 日糧中游離棉酚含量高于100 mg/kg時(shí)，可抑制成熟的卵泡分泌雌二醇和孕酮，造成卵巢萎縮，嚴(yán)重者喪失繁殖能力。蛋雞棉酚中毒時(shí)，會(huì)出現(xiàn)食欲減退，日漸消瘦四肢無(wú)力，嚴(yán)重者會(huì)抽搐，腹瀉，呼吸困難，冠髯發(fā)紺甚至死亡[4]。

游離棉酚在動(dòng)物體內(nèi)排泄緩慢，在體內(nèi)組織器官中具有蓄積效應(yīng)，且最主要的蓄積器官是肝臟[5]。脂肪酸的β-氧化是體內(nèi)脂肪酸分解的主要途徑，供應(yīng)體內(nèi)所需的大量能量[6]。任何因素引起的細(xì)胞線粒體功能損傷都會(huì)造成其氧化功能下降，致使甘油三酯增多，導(dǎo)致肝臟脂肪變性[7]。焦洪超等[8]研究發(fā)現(xiàn)棉酚急性毒性中毒會(huì)引起血漿中ALT、AST水平顯著升高，血液中TG顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，140 mg/kg游離棉酚會(huì)引起海賽克斯蛋雛雞貧血，并對(duì)維持肝臟正常的生理功能有不利影響[9]。游離棉酚引起的肝臟功能紊亂與氧化應(yīng)激和脂肪沉積的關(guān)系尚不明確。

本研究以京粉2號(hào)商品代蛋雞作為試驗(yàn)對(duì)象，在基礎(chǔ)飼料中添加醋酸棉酚，研究其對(duì)蛋雞肝臟脂質(zhì)過氧化、脂肪酸組成和血清生化指標(biāo)的影響，觀察肝細(xì)胞的病理及超微結(jié)構(gòu)的變化，探討游離棉酚對(duì)蛋雞肝臟脂肪代謝的影響及原因，為棉子粕在蛋雞飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)動(dòng)物

42周齡京粉2號(hào)商品代蛋雞，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（揚(yáng)州）家禽生產(chǎn)性能測(cè)定站提供。

1.2 ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)及基礎(chǔ)日糧

將360只42周齡京粉2號(hào)商品代蛋雞隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30羽。對(duì)照組、低劑量組（L組）在基礎(chǔ)日糧中添加醋酸棉酚100 mg/kg，中劑量組（M組）添加醋酸棉酚200 mg/kg，高劑量組（H組）添加醋酸棉酚400 mg/kg。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。采用3層全階梯籠養(yǎng)，每個(gè)重復(fù)單獨(dú)給料，自由采食飲水，日常管理與免疫程序按常規(guī)進(jìn)行，試驗(yàn)周期為6周。分別于試驗(yàn)第2周、第4周、第6周時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取10只雞翅靜脈采血5 mL，分離血清備測(cè)。試驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)抽取10只雞屠宰，采集肝臟，部分制作切片，剩余制備成勻漿后-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 ?測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 ?血清指標(biāo)的測(cè)定 ?使用全自動(dòng)血清生化測(cè)定儀，測(cè)定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量。

1.3.2 ?肝臟脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測(cè)定 ? 按照南京建成生物工程研究所提供的方法，將肝臟組織制作成10%的勻漿液，檢測(cè)相關(guān)酶的活性。

1.3.3 ?病理組織切片觀察 ? 取新鮮肝臟組織，固定于4%甲醛溶液中，每隔24 h更換1次甲醛溶液，更換2次，樣本可長(zhǎng)期保存。常規(guī)制作肝臟組織切片，HE染色觀察并拍照。

1.3.4 ?肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察 ? 迅速采集剛處死蛋雞的肝臟組織（切成約1 mm3小塊）， 用新鮮配制的25 g/L戊二醛溶液固定后，常規(guī)制備超薄切片，在JEM-100CXⅡ型透射電鏡（Philips公司）下觀察并拍照記錄。

1.4 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 17.0單因子方差分析數(shù)據(jù)，各處理間的平均值比較采用LSD及Duncans多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?醋酸棉酚對(duì)蛋雞血清生化指標(biāo)的影響

由表2可知，醋酸棉酚對(duì)血清中AST、ALT的影響呈現(xiàn)時(shí)間和劑量效應(yīng)。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)第2周時(shí)，H組血清中LDL-C顯著升高（P<0.05）。第4周、第6周時(shí)，M、H組血清中TG和LDL-C有所升高，且差異極顯著（P<0.01）。第4周、第6周時(shí)，H組血清中CHOL顯著升高（P<0.05）， HDL-C顯著升高（P<0.05）。

2.2 ?醋酸棉酚對(duì)蛋雞肝臟中脂肪酸組成的影響

肝臟中脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可以看出，試驗(yàn)組和對(duì)照組均未能檢測(cè)出肉豆蔻酸和亞麻酸;與對(duì)照組比較，3個(gè)試驗(yàn)組棕櫚酸和硬脂酸含量隨著醋酸棉酚添加量的增加有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著;棕櫚油酸、亞油酸含量隨著棉酚添加量的升高逐漸降低，H組中未檢測(cè)出油酸，M組油酸顯著降低（P<0.05）。棉酚使蛋雞肝臟飽和脂肪酸升高，不飽和脂肪酸降低。

2.3 ?醋酸棉酚對(duì)蛋雞肝臟脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的影響

肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可以看出，與對(duì)照組比較，L組各項(xiàng)脂質(zhì)過氧化指標(biāo)與對(duì)照組不存在顯著差異（P>0.05）;M組GSH-Px活性顯著降低（P<0.05），SOD活性、GSH含量極顯著降低（P<0.01）;H組SOD、GSH-Px、GSH均極顯著降低（P<0.01）; M組和H組MDA含量均極顯著升高（P<0.01）。

2.4 ?醋酸棉酚導(dǎo)致蛋雞肝臟組織的病理變化及其對(duì)肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響

肝臟病理切片觀察結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，對(duì)照組肝臟部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量小脂肪滴;低劑量組肝臟中局部肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量大脂肪滴;中劑量組肝臟中局部肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量較大脂肪滴;高劑量組肝臟中局部肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量大脂肪滴。相比于飼喂含醋酸棉酚日糧的蛋雞，尤其是高劑量組的蛋雞，對(duì)照組肝臟組織中發(fā)生明顯的脂肪變性，肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基本輪廓消失。

肝臟組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見圖2。由圖2可知，對(duì)照組線粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，嵴完整，清晰，表明其功能正常;低劑量組線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，個(gè)別內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊;中劑量組線粒體外膜結(jié)構(gòu)完整，部分嵴斷裂，有空泡化的趨勢(shì);高劑量組線粒體大部分嵴斷裂，內(nèi)膜溶解，呈空泡化（圖中箭頭所示）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組存在不同程度的脂滴增加的情況，且細(xì)胞中空泡數(shù)量增多。

3 ?討論

游離棉酚的毒性主要是其結(jié)構(gòu)中含有醛基和羥基，其在動(dòng)物體內(nèi)肝臟中會(huì)發(fā)生明顯的蓄積作用[10]。日糧中添加棉粕會(huì)導(dǎo)致肝臟組織脂肪變性，肝小葉變性壞死。病禽剖檢后發(fā)現(xiàn)為肝充血，膽囊腫大。已有的研究認(rèn)為，棉酚與金屬離子結(jié)合，破壞了離子原有的功能。棉酚與鐵離子結(jié)合，干擾血紅蛋白的合成，引起機(jī)體缺鐵性貧血;與氨基酸殘基結(jié)合，可使一些蛋白質(zhì)及蛋白酶類失去活性。1976年，Abou-Donia[11]通過同位素標(biāo)記技術(shù)研究了棉酚在肝臟亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布，發(fā)現(xiàn)棉酚主要聚集在微粒體和線粒體膜上，在胞核內(nèi)的含量則很少。

AST和ALT是肝功能檢查中的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其偏高提示肝臟可能出現(xiàn)不同程度的損傷，如急性肝炎、酒精肝和脂肪肝等。丁耿芝等[12]研究表明，隨著游離棉酚含量的增加，ALT和AST呈上升趨勢(shì)，表明肝臟受到一定程度的損害。Braham等[13]和Abou-donia等[14]研究顯示，棉酚可引起肝臟損傷，導(dǎo)致AST活性升高。楊茹潔[15]也發(fā)現(xiàn)高棉酚飼糧對(duì)蛋雞AST的活性影響極顯著，并且有時(shí)間效應(yīng)。本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)此變化，呈現(xiàn)時(shí)間與劑量效應(yīng)。血清中LDL-C、TG、CHOL、HDL-C等指標(biāo)的變化，提示蛋雞攝入游離棉酚后出現(xiàn)肝臟損傷和脂肪沉積。這與焦洪超等[16]的研究結(jié)果較為相似，蛋雞飼料中添加棉酚后造成蛋雞肝臟脂肪代謝異常。通過對(duì)脂肪酸組成的研究發(fā)現(xiàn)，游離棉酚影響了肝臟的脂肪酸組成，導(dǎo)致飽和脂肪酸升高、不飽和脂肪酸下降。

動(dòng)物機(jī)體在正常情況下，處于動(dòng)態(tài)的氧化平衡中，當(dāng)機(jī)體受到不良應(yīng)激時(shí)，該平衡就會(huì)被打破，表現(xiàn)為抗氧化能力降低或機(jī)體產(chǎn)生過多的氧自由基[17]。SOD在細(xì)胞漿中和線粒體基質(zhì)中起重要的防御作用[18]， SOD是機(jī)體抗脂過氧化酶促防御系統(tǒng)中的一個(gè)重要酶，能有效清除氧自由基。GSH-Px可清除線粒體及胞漿中所產(chǎn)生的H2O2和脂類中的H2O2。MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體氧自由基升高時(shí)，MDA也會(huì)顯著升高。當(dāng)自由基在高濃度時(shí)，會(huì)引起機(jī)體氧化損傷。同時(shí)會(huì)造成DNA、蛋白質(zhì)及脂肪損傷。其中脂肪損傷主要攻擊的對(duì)象是不飽和脂肪酸。在細(xì)胞內(nèi)，棉酚可以結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜，同時(shí)棉酚與氨基酸非特異性共價(jià)結(jié)合使棉酚成為普遍的酶抑制劑[19]。本研究表明，隨著棉酚劑量的增加，蛋雞肝臟中SOD、GSH-Px活性逐漸降低，MDA含量逐漸升高，且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，表明棉酚引起蛋雞肝臟的氧化損傷，這也是造成肝細(xì)胞脂肪沉積的原因之一。

張志峰等[20]研究報(bào)道， 飼糧游離棉酚含量為162.5 mg/kg時(shí)，導(dǎo)致育肥豬中毒死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝臟體積增大，質(zhì)地變硬，呈現(xiàn)暗紅色，腹腔中有大量炎性滲出物，切片觀察發(fā)現(xiàn)部分肝細(xì)胞萎縮壞死，結(jié)構(gòu)模糊，小葉間纖維結(jié)締組織增生，間隔增寬。劉錫民[21]報(bào)道，棉酚中毒患者臨床上均有不同程度的肝細(xì)胞萎縮和輕度脂肪變性。焦洪超[7]研究發(fā)現(xiàn)飼喂40、200 mg/kg棉酚及腹腔注射棉酚導(dǎo)致蛋雞肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞輪廓消失，腫脹、炎性浸潤(rùn)，并且有明顯的脂肪變性。本研究發(fā)現(xiàn)游離棉酚導(dǎo)致肝臟最主要的病理變化就是肝細(xì)胞脂肪變性，進(jìn)一步對(duì)肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，游離棉酚對(duì)線粒體產(chǎn)生損傷，并且呈一定的劑量效應(yīng)。因此，肝細(xì)胞中脂肪的堆積可能與線粒體受損導(dǎo)致的氧化功能下降有關(guān)，而線粒體的受損又進(jìn)一步加劇了肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

綜上所述，醋酸棉酚引起蛋雞肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致線粒體等細(xì)胞器功能受損氧化功能下降在蛋雞肝臟的脂肪沉積過程中發(fā)揮了重要作用。

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