姚玉榮，霍建飛，郝永娟，賁海燕，王萬(wàn)立

（1.天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司／蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津市植物保護(hù)研究所，天津 300384）

花椰菜（Brassica oleraceaL.var.botrytis）是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)的變種，以花球?yàn)槭秤闷鞴俚氖卟??；ㄒ顺卸喾N營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有類(lèi)黃酮、硫代葡萄糖苷、黑子芥酶等生物活性成分［1］，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。據(jù)2018年FAO（聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織）報(bào)告顯示，全世界花椰菜的栽培面積約141.78萬(wàn)公頃，中國(guó)為54.79萬(wàn)公頃，占世界總栽培面積的38.64%［2］，現(xiàn)已成為世界上花椰菜種植面積最大的國(guó)家。

黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestiss引起的細(xì)菌性病害［3］，也是制約花椰菜生產(chǎn)的主要病害之一，發(fā)病率為20% ～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50% ～60%［4］。目前，黑腐病防治方法主要有農(nóng)事操作如輪作、化學(xué)防治和選育抗性品種等。其中，最經(jīng)濟(jì)有效的措施為培育和利用抗病品種。由于尚未找到有效抗原，前期研究對(duì)黑腐病抗病基因的挖掘和鑒定進(jìn)展緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，RNA-Seq技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因差異表達(dá)研究［5-7］。Chu等［8］利用RNA-Seq技術(shù)從抗、感白菜植株中鑒定出2 000多個(gè)呈現(xiàn)差異表達(dá)的基因，它們主要在茉莉酸和乙烯信號(hào)通路、胼胝質(zhì)沉淀及吲哚類(lèi)物質(zhì)合成等過(guò)程中發(fā)揮作用，且均在抗病植株中表達(dá)水平顯著上調(diào)。Chen等［9］通過(guò)對(duì)大白菜根腫病抗病和感病品種轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析發(fā)現(xiàn)，抗、感品種間存在151個(gè)抗病相關(guān)差異基因，主要參與PAMPs、效應(yīng)子識(shí)別、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞壁修飾等過(guò)程。Zhang等［10］對(duì)不同根腫菌侵染時(shí)期的青花菜轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，抗、感品種間在NBS-LRR基因、SA代謝相關(guān)基因、JA代謝相關(guān)基因、細(xì)胞壁重塑基因、幾丁質(zhì)酶基因等存在表達(dá)差異，這些基因參與寄主對(duì)病原菌抗病響應(yīng)途徑，從而使抗、感品種呈現(xiàn)不同抗病性。郭珍等［11］對(duì)接菌后油菜根腫病抗、感品種基因進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，它們分別存在6 607個(gè)和2 499個(gè)差異表達(dá)基因。雷陽(yáng)等［12］對(duì)114份辣椒群體進(jìn)行抗疫病鑒定，并對(duì)篩選得到的1份抗病材料和3份感病材料進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)三組材料中有331個(gè)差異表達(dá)基因，包括68個(gè)上調(diào)基因和263個(gè)下調(diào)基因。

目前，多基因控制的抗性機(jī)制的研究在擬南芥中較為成熟［13］，且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，十字花科黑腐病抗性是多基因控制的數(shù)量性狀［14］。因此，利用轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)研究十字花科黑腐病抗性機(jī)制具有可行性。基于此，本研究利用RNA-Seq技術(shù)測(cè)定并分析花椰菜黑腐病抗、感品種間抗病相關(guān)基因的差異表達(dá)，以期為后續(xù)抗病基因的挖掘及花椰菜抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種：花椰菜黑腐病感病品種Y1-2和抗病品種EC-247，均由天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所提供。

供試菌株：黑腐病菌為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestiss，由天津市植物保護(hù)研究所蔬菜病害實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 樣品制備

試驗(yàn)于2019年4月在天津市植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。育苗基質(zhì)為蛭石∶草炭∶土壤＝1∶1∶2（體積比），滅菌后備用。將花椰菜黑腐病抗、感品種的種子分別用50℃熱水處理10 min后播于育苗穴盤(pán)內(nèi)，置于防蟲(chóng)網(wǎng)室培養(yǎng)。加強(qiáng)栽培管理，使幼苗生長(zhǎng)健壯、整齊一致。

接種菌液的準(zhǔn)備：將黑腐病菌菌株轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基上，置于28℃搖床恒溫培養(yǎng)24 h，加適量無(wú)菌水稀釋?zhuān)⒂眉?xì)菌濁度儀調(diào)整菌液濃度至每毫升1×108個(gè)菌體，備用。

于各幼苗長(zhǎng)至4～5片真葉時(shí)移到人工氣候室內(nèi)保濕24 h，使其葉緣出現(xiàn)露珠。參照姚星偉等［15］的方法進(jìn)行接種：將制備接種菌液用小型噴霧器進(jìn)行噴霧接種，均勻噴至幼苗葉片。幼苗接種后培養(yǎng)條件為28℃、相對(duì)濕度80%，每天光照14 h。

接種5 d后觀察發(fā)病情況，同時(shí)用無(wú)菌剪刀剪下葉片并迅速置于液氮中，再將其移至-80℃保存?zhèn)溆?。每品種設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)15株幼苗。

1.3 RNA提取、測(cè)序及組裝

將抗、感品種的每個(gè)重復(fù)混合磨樣，用Trizol試劑提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性和純度，NanoDrop 2000檢測(cè)RNA濃度，合格后送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行Illunmina測(cè)序。

利用Trinity軟件對(duì)6個(gè)樣本的clean reads從頭組裝，用于后續(xù)分析。

1.4 差異表達(dá)基因分析及注釋

利用RSEM 軟件將每個(gè)花椰菜樣本clean reads比對(duì)到參考序列，每個(gè)基因表達(dá)水平用FPKM值計(jì)算，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的基因，選擇最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本計(jì)算FPKM值。使用DESeq2軟件篩選2個(gè)樣本間的差異表達(dá)基因（differential expressed genes，DEGs）。為減少假陽(yáng)性，對(duì)P-value值進(jìn)行矯正，矯正后P-value＜0.05，｜log2FC｜＞1設(shè)為基因差異顯著表達(dá)閾值。

所有表達(dá)基因基于6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋?zhuān)ǎ篘R（non-redundant protein sequence database）、Swiss-Prot、Pfam、COG（clusters of orthologous groups）、GO（gene ontology）、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）。對(duì)于具有多個(gè)匹配蛋白序列的基因，選取相似性最高的蛋白質(zhì)作為最優(yōu)注釋。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用RSEM軟件計(jì)算抗、感品種生物學(xué)重復(fù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，并繪制基因表達(dá)矩陣圖對(duì)樣本間基因表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。利用DESeq2軟件繪制差異表達(dá)基因火山圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種黑腐病病菌后葉片發(fā)病情況

由圖1可以看出，黑腐病病原菌懸浮液接種5 d后，感病品種Y1-2葉片表現(xiàn)出黑腐病典型的“V”形黃褐色病斑，而抗病品種EC-247葉片未呈現(xiàn)該典型病斑。

2.2 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量分析

對(duì)花椰菜感病品種Y1-2及抗病品種EC-247接種5 d后的樣本進(jìn)行測(cè)序后，本研究構(gòu)建了6個(gè)cDNA文庫(kù)。過(guò)濾后獲得49.01×106～55.39×106個(gè)平均片段為150 bp的clean reads，GC含量為47.15%～47.80%，Q≥30占比為93.63%～95.16%（表1），表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分析。

2.3 樣本間基因表達(dá)量分析

花椰菜抗、感品種間基因表達(dá)量相關(guān)性的聚類(lèi)分析結(jié)果（圖2A）顯示，抗病品種EC-247和感病品種Y1-2樣本各自聚在一起，且表達(dá)差異明顯。試驗(yàn)中EC-247 5DAI_1～3（E_5DAI）和Y1-2 5DAI_1～3（Y_5DAI）的unigenge數(shù)量分別為24 227、25 436個(gè)，6個(gè)樣本共表達(dá)的unigene數(shù)量為22 570個(gè)（圖2B）。

2.4 基因表達(dá)差異分析

由圖3可以看出，花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達(dá)基因共3 195個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因1 424個(gè)，占差異表達(dá)基因的44.57%；下調(diào)表達(dá)基因1 771個(gè)，占差異表達(dá)基因的55.43%。因此，抗、感品種差異顯著性強(qiáng)的基因可能與花椰菜黑腐病抗病性相關(guān)。

圖2 抗、感病花椰菜品種間基因表達(dá)量相關(guān)性分析（A）和基因表達(dá)韋恩圖（B）

圖3 花椰菜黑腐病抗、感品種轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量差異統(tǒng)計(jì)（A）和差異表達(dá)基因火山圖（B）

2.5 差異表達(dá)基因的功能注釋與富集分析

由圖4可以看出，GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，抗、感品種在接種黑腐病菌5 d時(shí)，差異表達(dá)基因被富集到3個(gè)GO分類(lèi)，分別是細(xì)胞組成、分子功能和生物代謝。差異表達(dá)基因富集數(shù)目最多的功能是細(xì)胞組成，其中以細(xì)胞膜（membrane）、細(xì)胞（cell）和細(xì)胞膜部分（membrane part）數(shù)量最多，占比為55.92%；生物代謝分類(lèi)中基因富集數(shù)目最多的功能是細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程以及單有機(jī)體過(guò)程；分子功能注釋基因主要包括結(jié)合（binding）749個(gè)基因，占比46.55%、催化活性（catalytic activity）606個(gè)基因，占比37.66%。

圖4 花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達(dá)基因GO功能注釋

將花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達(dá)基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，挖掘抗病和感病品種中差異基因顯著富集的KEGG通路（圖5）。其中上調(diào)表達(dá)基因富集到94條通路，顯著富集的主要包括苯丙素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis），N-聚糖生物合成（N-glycan biosynthesis），亞油酸代謝（linoleic acid metabolism），二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素的生物合成（stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis），苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism），角質(zhì)、軟木脂和蠟質(zhì)生物合成（cutin，suberine and wax biosynthesis），氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism），類(lèi)固醇生物合成（steroid biosynthesis）和光合作用（photosynthesis）共9條通路（圖5A）。下調(diào)基因富集到87條通路，顯著富集的有錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair）、DNA復(fù)制（DNA replicatioin）、核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair）、同源重組（homologous recombination）、醚脂類(lèi)代謝（ether lipid metabolism）、苯丙素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、植物晝夜節(jié)律（circadian rhythm plant）、類(lèi)黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、植物-病原互作（plant-pathogen interaction）、植物MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway-plant）、核黃素代謝（riboflavin metabolism）11條代謝通路（圖5B）。

圖5 花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達(dá)基因KEGG通路

3 討論與結(jié)論

本研究利用RNA-Seq技術(shù)分析了黑腐病菌野油菜黃單胞菌野油菜致病變種接種5 d后的花椰菜抗、感病品種間基因轉(zhuǎn)錄差異，得出抗病品種E_5DAI和感病品種Y_5DAI的unigenge數(shù)量分別為24 227、25 436個(gè)，6個(gè)樣本共表達(dá)的unigene數(shù)量為22 570個(gè)；花椰菜抗、感病品種間共有差異表達(dá)基因3 195個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因1 424個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因1 771個(gè)。通過(guò)GO和KEGG進(jìn)行基因功能注釋和顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在苯丙素生物合成，N-聚糖生物合成，亞油酸代謝，二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素的生物合成，苯丙氨酸代謝，角質(zhì)、軟木脂和蠟質(zhì)生物合成，氨基糖和核苷酸糖代謝，以及類(lèi)固醇生物合成和光合作用等途徑；下調(diào)表達(dá)基因主要富集在錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)、同源重組、醚脂類(lèi)代謝、苯丙素生物合成、植物晝夜節(jié)律、類(lèi)黃酮生物合成、植物-病原互作、植物MAPK信號(hào)通路和核黃素代謝等代謝通路。該類(lèi)差異基因主要集中于苯丙烷類(lèi)代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、逆境響應(yīng)、MAPK信號(hào)通路等途徑。

苯丙烷類(lèi)代謝是植物防御反應(yīng)的主要次級(jí)代謝路徑之一，參與植保素、木質(zhì)素、類(lèi)黃酮、生物堿等與植物防御反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)的合成［16，17］，這些物質(zhì)對(duì)真菌、細(xì)菌有抑制活性［18-21］。本研究中花椰菜黑腐病抗、感品種差異表達(dá)基因在類(lèi)黃酮生物合成通路顯著富集。因此，推測(cè)類(lèi)黃酮途徑與花椰菜黑腐病抗病性相關(guān)。核黃素能夠提高植物抗病性，彭建令［22］發(fā)現(xiàn)核黃素能夠啟動(dòng)番茄Pto介導(dǎo)的Ptis級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高對(duì)細(xì)菌的抗性。此外，蛋白酶類(lèi)可通過(guò)磷酸化和去磷酸化參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞反應(yīng)，應(yīng)答環(huán)境脅迫［23，24］。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序?qū)ㄒ丝共『透胁∑贩N接種黑腐病后基因轉(zhuǎn)錄本差異進(jìn)行了分析，可為在轉(zhuǎn)錄水平上全面了解花椰菜抗黑腐病的分子基礎(chǔ)提供參考。