李慶華，王因花，燕麗萍，劉翠蘭，吳德軍，韓邦友，李麗

（1.山東省林業(yè)科學研究院／山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250014；2.山東省調(diào)水工程運行維護中心，山東 濟南 250014）

日本柳杉［Cryptomeria japonica（L.f.）D.Don］原產(chǎn)于日本，喬木，高達48 m，適合在濕潤氣候下生長，我國南京、上海、四川、江蘇等地均有引種栽培。該樹種防風固沙、保持水土，是營造沿海防護林和荒山荒灘造林綠化的先鋒樹種［1，2］。凍害是北方栽培區(qū)種植日本柳杉常見的一種生理性病害，日本柳杉幾乎每年都要遭受不同程度的凍害，給其生產(chǎn)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。因此，鑒定不同日本柳杉種質的抗寒性，篩選抗寒性強的種質，對日本柳杉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、利用創(chuàng)新及其合理栽培區(qū)劃都具有重要的支撐作用。

目前，關于日本柳杉抗寒性的研究報道甚少。Eguchi等［3］通過對自然條件下的凍害率、細胞滲透濃度等指標的測定比較了日本柳杉的抗寒性，初步篩選出62株抗寒個體，但對各品種抗寒性的了解十分有限。本研究以13個無性系日本柳杉為材料，研究不同低溫脅迫處理下其葉片相對電導率及丙二醛、可溶性糖、游離脯氨酸含量等抗寒性指標的變化情況，并利用隸屬函數(shù)法對其抗寒性進行綜合評價，以期為日本柳杉種質的抗寒性評價和抗寒種質選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及材料

試驗所用日本柳杉（種質編號分別為L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12和L13）均種植于日照高科技創(chuàng)新園基地，該地位于東經(jīng)118°25′～119°39′，北緯35°04′～36°04′，年平均降水量為874 mm，年平均氣溫為12.6℃，極端最低氣溫-13.8℃。于2018年8月18日剪取生長整齊健壯的秋梢，培養(yǎng)在裝有細沙的盆中，備用。

1.2 試驗處理

將秋梢移入人工氣候箱內(nèi)進行不同低溫（0、-5、-10、-15℃）脅迫處理，各處理均以5℃／h的速率降溫，達到預定溫度后保持12 h，以常溫（25℃）條件下生長的秋梢作為對照（CK），每處理重復3次，處理完畢后取樣進行相關指標的測定。

1.3 測定指標及方法

采用電導法測定相對電導率［4］；采用硫代巴比妥酸（TBA）反應法測定丙二醛（MDA）含量，蒽酮比色法測定可溶性糖含量，酸性茚三酮法測定游離脯氨酸（Pro）含量［5］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

利用隸屬函數(shù)法［6］對不同日本柳杉抗寒性進行綜合評價。隸屬函數(shù)值計算公式：

反隸屬函數(shù)值計算公式：

平均隸屬函數(shù)值計算公式：

式中，A表示各材料指標的隸屬函數(shù)值，且A∈［0，1］；Hmin、Hmax表示各參試材料的最小值、最大值；B為材料的模糊隸屬函數(shù)均值，n為指標數(shù)。根據(jù)上述公式，分別計算出每個種質各項指標的隸屬函數(shù)值后，用平均隸屬函數(shù)值進行各種質抗寒能力綜合評價，隸屬函數(shù)均值越大，表明耐寒性越強。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對日本柳杉葉片相對電導率的影響

由表1可以看出，不同日本柳杉葉片相對電導率整體隨處理溫度的降低而逐漸升高。L4、L6、L9和L11葉片相對電導率隨著處理溫度的降低變化緩慢，而L3、L5、L8和L12等則表現(xiàn)為迅速增大。25℃處理下，各種質葉片相對電導率差異均不顯著（P＞0.05），表明此時日本柳杉細胞膜沒有受到明顯破壞。當?shù)蜏靥幚頌?℃時，L3、L5、L8和L12葉片相對電導率顯著高于其它材料，而其它材料間的葉片相對電導率均差異不顯著。當處理溫度為-5、-10℃時，不同種質葉片相對電導率存在明顯差異，部分達到顯著水平。但當處理溫度為-15℃時，各種質間葉片相對電導率差異均不顯著，表明該溫度條件下各種質日本柳杉細胞膜均已遭受嚴重破壞。

表1 低溫脅迫下日本柳杉的葉片相對電導率 （%）

2.2 低溫脅迫對日本柳杉葉片丙二醛含量的影響

由圖1可以看出，隨著處理溫度降低，L10葉片丙二醛含量表現(xiàn)為不斷升高，其余日本柳杉種質葉片丙二醛含量隨處理溫度降低整體呈先上升后下降趨勢。不同日本柳杉葉片中MDA的最大含量和變化幅度均不同，L5、L13、L12、L8和L3的葉片MDA含量受溫度變化影響較大，而L11、L9和L6葉片MDA含量受溫度變化影響較小。

2.3 低溫脅迫對日本柳杉葉片可溶性糖含量的影響

由圖2可以看出，隨著處理溫度的逐漸降低，13種日本柳杉葉片可溶性糖含量均呈先上升后下降趨勢。在25℃處理下，13種日本柳杉葉片可溶性糖含量差異不大；當處理溫度低于0℃后，L6葉片可溶性糖含量最高，并在-10℃時達到峰值，為11.24%；其它日本柳杉葉片可溶性糖含量均在-5℃時最高，峰值為4.14% ～9.94%。不同日本柳杉種質可溶性糖含量排序從高到低為L6＞L11＞L4＞L9＞L1＞L2＞L10＞L7＞L8＞L12＞L13＞L5＞L3。

2.4 低溫脅迫對日本柳杉葉片游離脯氨酸（Pro）含量的影響

由圖3可以看出，13種日本柳杉葉片Pro含量均隨處理溫度的降低呈先上升后下降的趨勢。L2、L4、L6、L9和L11葉片Pro含量的最高值均出現(xiàn)在-10℃時，其中，L11最高，L6、L4次之，L9較低，L2最低，但均分別比25℃時增加5.49、5.44、5.30、3.86倍和2.40倍。L1、L3、L5、L7、L8、L10、L12和L13葉片Pro含量峰值均出現(xiàn)在-5℃時，含量從高到低依次為L1＞L10＞L13＞L3＞L8＞L7＞L5＞L12，分別比25℃時增加2.72、2.64、2.62、2.09、1.86、1.82、1.82倍和1.60倍。

2.5 13個日本柳杉抗寒性綜合評價

為了較全面地研究本試驗材料的抗寒性，運用隸屬函數(shù)法，通過4個抗寒指標平均隸屬度進行綜合評價，確定不同日本柳杉種質的抗寒性。由表2可以看出，13個日本柳杉抗寒性從強到弱依次為：L11＞L6＞L4＞L9＞L2＞L1＞L10＞L7＞L13＞L8＞L3＞L5＞L12。

表2 日本柳杉葉片抗寒性評價

3 討論與結論

低溫脅迫下，植物會發(fā)生一系列的生理生化和大分子變化以及生物膜結構改變等以適應低溫逆境［7，8］。相對電導率和丙二醛含量的變化能夠直觀反映抗逆環(huán)境中植物細胞膜的受損程度。大多數(shù)研究表明，植物在低溫逆境條件下細胞膜透性增大、胞內(nèi)電解質外滲，進而引起電導率升高［5］。本研究中，日本柳杉在低溫脅迫處理下電導率和MDA 含量均增大。該結果與其它物種［9，10］上的研究報道類似。

可溶性糖和游離脯氨酸是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質，其含量高低與植物耐寒性密切相關［11，12］。在低溫脅迫下，糖類代謝主要調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生物合成和蛋白質分解之間的平衡，降低冰點、緩和細胞質過度脫水，從而調(diào)節(jié)植物在逆境脅迫下的適應性，提高植物的抗寒能力［13，14］。植物在低溫逆境中可通過調(diào)節(jié)原生質與環(huán)境的滲透平衡，防止細胞結構受破壞，增強保護作用［15］。本研究表明，日本柳杉可溶性糖和游離脯氨酸含量均隨處理溫度的降低呈先上升后下降的趨勢。這與李瑞雪［16］、劉貝貝［17］等的研究結果一致。

采用單一指標評價參試材料的抗寒性會產(chǎn)生較大誤差，這可能由于樣品本身、自然環(huán)境和生理狀況的不同，導致不同的生理指標對同一批次樣品的抗寒性評價結果不一致［18］。采用隸屬函數(shù)法能夠較全面地分析判斷植物抗寒能力，盡可能地克服采用單個指標的片面性［19］。目前這種方法已經(jīng)在板栗、果樹和扁桃等樹種的抗寒性鑒定中廣泛應用［18，20，21］。本研究運用隸屬函數(shù)法計算了與日本柳杉葉片抗寒性密切相關的4個指標的平均隸屬度，對13個日本柳杉葉片抗寒性進行了綜合分析排序，并初步篩選得到高抗寒品種。說明采用隸屬函數(shù)法能夠較為科學地評價和區(qū)分日本柳杉的抗寒性強弱，具有較強的適用性。本研究對擬引入的日本柳杉株系在本地的抗寒表現(xiàn)進行科學預判，以避免盲目引種帶來的生產(chǎn)損失。

本研究利用隸屬函數(shù)法綜合評價13個日本柳杉抗寒性，得出其抗寒性由強到弱依次為：L11＞L6＞L4＞L9＞L2＞L1＞L10＞L7＞L13＞L8＞L3＞L5＞L12，并篩選出L11、L6、L4和L9共4個耐寒性強的種質。