吳俊藝， 賴智德， 田毅峰， 王耀東

1 福建省立醫(yī)院 肝膽胰外科， 福州 350001; 2 南京大學醫(yī)學院附屬南京鼓樓醫(yī)院 肝膽胰外科， 南京 210008

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，HCC的發(fā)展具有多種癌癥特征，如持續(xù)性細胞增殖、逃避凋亡、誘導血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等[1]。目前較為公認的有效HCC治療方式主要是手術(shù)切除及肝移植，但是HCC發(fā)病隱匿，進展迅速，絕大多數(shù)腫瘤一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即是晚期，從而失去手術(shù)時機[2]。因此，深入研究HCC的發(fā)病機制、尋找新的HCC早期診斷標志物具有重要意義。目前臨床上AFP的檢測是HCC篩查的主要手段，但是其對HCC的敏感性較低，所以尋找其他對HCC具有特異性的腫瘤標志物尤為重要[3]。最近，多項研究[4-5]結(jié)果表明，血清外泌體中異常表達的microRNA(miRNA)與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后緊密相關(guān)，可能成為一種新型的腫瘤診斷分子標志物。然而，關(guān)于血清外泌體來源的miRNAs在HCC診斷及預后中的研究相對較少。本研究分析血清外泌體來源miRNA-221-3p的表達水平與HCC患者的臨床特征及預后的相關(guān)性，旨在探討血清外泌體來源miRNA-221-3p作為新型分子標志物在HCC早期診斷及預后判斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2010年2月-2014年12月南京大學醫(yī)學院附屬南京鼓樓醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療后組織病理診斷為HCC的66例患者進行回顧性研究，選取25例同期在本院接受健康檢查的體檢者作為對照組。隨訪截止時間 2019年2月，HCC患者的生存時間為從手術(shù)開始到因任何原因死亡或最后1次隨訪的時間。診斷及臨床分期參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范( 2017年版)》[6]。入選標準：(1)首次手術(shù)切除患者，術(shù)后病理診斷為HCC; (2) 無其他心肺腎等嚴重基礎(chǔ)疾病。排除標準: (1)臨床資料不完整及失訪者; (2) 合并心、肺、腎等嚴重基礎(chǔ)疾病者; (3) 非原發(fā)病灶者; (4) 妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 主要試劑 外泌體提取試劑盒ExoQuickTM Kit購買自美國System Biosciences公司，CD63抗體、Alix抗體和HSP70抗體購買自美國Abcam公司，Trizol RNA 提取試劑購買自美國 Life Technologies 公司，RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green Real-time PCR 試劑盒購買自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌體的提取 分別取HCC組及對照組血清，根據(jù)ExoQuickTM Kit說明書提取血清外泌體，根據(jù)后續(xù)實驗需要用PBS緩沖液、蛋白質(zhì)裂解液及RNA裂解液重懸沉淀。

1.3.2 透射電子顯微鏡檢測血清外泌體 血清外泌體(10 μg)滴于專用銅網(wǎng)上(購自北京中興科依科技有限公司)，1%戊二醛固定液固定10 min，PBS緩沖液漂洗，室溫靜置待揮干，2%磷鎢酸負染后采用透射電子顯微鏡(JEM-2100)在100 kV電壓下進行觀察并拍照。

1.3.3 蛋白免疫印跡 通過含有蛋白酶抑制劑的裂解液重懸血清外泌體后提取總蛋白進行分析。將提取后的蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，以5%脫脂牛奶封閉1 h后，anti-HSP70及anti-CD63一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS緩沖液沖洗后二抗孵育1 h，采用化學發(fā)光法顯色并拍照(Tanon 5200成像系統(tǒng))。

1.3.4 實時熒光定量PCR miRNA-221-3p引物，上游：5′-AGACCTGATACTGAGTGAAG-3′，下游：5′-GACGTCGAGATCGCATAG-3′；U6 引物，上游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′，下游：3′-CAGCATAGGTCACGTCCCAGGCTCCATAAGCGTGACCTATGCTCTTTTAT-5′，由廣州銳博公司設(shè)計與合成。用RNA提取試劑(Trizol)重懸血清外泌體后，按照常規(guī)Trizol法提取血清外泌體的總RNA，測定提取總RNA濃度，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 保持。逆轉(zhuǎn)錄后按照SYBR Green Real-time PCR試劑盒說明書操作，條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復性34 s，重復2、3步驟40個循環(huán)，血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達水平采用2-ΔΔCt計算。

1.4 倫理學審查 本研究通過南京大學醫(yī)學院附屬南京鼓樓醫(yī)院倫理委員會批準(批號：20180120)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗。采用 Kaplan-Meier方法及 log-rank 檢驗分析HCC患者的預后，采用 Cox 比例風險回歸模型分析預后的影響因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體的形態(tài)特征 血清外泌體可表達HSP70、CD63和Alix(圖1a)，外泌體外觀為圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為40～100 nm(圖1b)。

2.2 HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p的表達水平HCC組血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(U=354.00，P<0.001)(圖2)。

2.3 HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p的表達水平與臨床病理特征及預后的關(guān)系 根據(jù)HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p的表達水平升高3倍設(shè)定為cut-off值，將其分為高表達組(n=40)和低表達組(n=26)。HCC患者血清外泌體中miR-221-3p高表達組與低表達組的腫瘤大小(χ2=6.016，P=0.014)、包膜侵犯(χ2=7.580，P=0.006)和TNM分期(χ2=6.340，P=0.012)比較差異均有統(tǒng)計學意義，而在性別、年齡、乙型肝炎、分化程度、AFP以及肝硬化等方面差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。Kaplan-Meier生存曲線的結(jié)果顯示，高表達組的總生存期明顯短于低表達組(χ2=17.105，P<0.001)(圖3)。

表1 HCC患者血清外泌體miRNA-221-3p的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 HCC患者的預后危險因素分析 采用 Cox 比例風險回歸模型分析HCC患者的預后危險因素，單因素分析結(jié)果顯示:腫瘤大小、包膜侵犯、TNM分期及血清外泌體中miRNA-221-3p的表達水平是HCC患者預后的危險因素(P值均<0.05)。多因素Cox分析結(jié)果顯示：血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達水平[風險比(HR)=2.434，95%可信區(qū)間(95%CI): 1.178～5.027，P=0.016]及TNM分期(HR=2.653，95%CI: 1.222～5.760，P=0.014)是影響HCC患者預后的獨立危險因素(表2)。

表2 影響HCC患者預后的危險因素分析

3 討論

外泌體是一種直徑40～100 nm的膜性囊泡，廣泛分布在人體體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等[7]。外泌體含有多種生物活性的成分，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和miRNA等，參與細胞間通訊、免疫應(yīng)答、蛋白及核酸運輸?shù)壬磉^程[7]。越來越多的研究[8-9]表明，內(nèi)含于外泌體中的多種miRNAs在惡性腫瘤的發(fā)病及進展中具有重要作用，可以作為腫瘤早期診斷及預后判斷的新型分子標志物。外泌體中miRNA可簡便地從血清中收集，并且其分析相對簡單。檢測外泌體中miRNA的表達水平是無創(chuàng)性的，因此外泌體中miRNA具有成為早期癌癥篩查生物標志物的潛力。

以往研究[10-11]發(fā)現(xiàn)HCC患者血清外泌體中miRNA-21的表達水平升高且與預后相關(guān)，而血清中miRNA-21表達水平相對較低，說明血清外泌體中miRNA異常表達對HCC的早期診斷及預后判斷更具潛在價值。另一種血清外泌體來源的miRNA-125b可以作為預測HCC預后的指標[12]。另有Qu等[13]研究發(fā)現(xiàn)外泌體來源的miRNA-665與HCC患者包膜浸潤、腫瘤大小、臨床分期及總生存期等密切相關(guān)。張云等[14]研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體來源的miRNA-122對HCC的診斷效能明顯高于AFP，可作為一種新型的用于HCC早期臨床診斷的分子標志物。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA-718與肝移植術(shù)后HCC患者的預后相關(guān)，并且最近研究[16-17]發(fā)現(xiàn)血清外泌體中miRNA-224和miRNA-638可以促進HCC的進展，與HCC的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)。但是目前血清外泌體中miRNA在HCC的早期臨床診斷及其發(fā)生發(fā)展中的作用和具體分子機制仍需要進一步研究。

本課題組通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，血清外泌體含有HSP70、Alix及CD63標志性蛋白，通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)血清外泌體外觀為圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為40～100 nm，符合外泌體形態(tài)。通過實時熒光定量PCR檢測HCC組及對照組中血清外泌體來源的miRNA-221-3p的表達水平，發(fā)現(xiàn)在HCC患者中，血清外泌體來源的miRNA-221-3p表達水平高于對照組，并且miRNA-221-3p高表達與HCC患者腫瘤大小、包膜侵犯及臨床分期等密切相關(guān)，提示其表達水平與HCC患者較差的臨床病理特征有關(guān)。在此研究基礎(chǔ)上，采用Kaplan-Meier生存曲線分析血清外泌體來源miRNA-221-3p的表達水平與總生存期的關(guān)系，結(jié)果顯示，miRNA-221-3p高表達組的總生存期明顯短于低表達組，預后不佳。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中miRNA-221-3p的表達水平及腫瘤分期是HCC患者預后的獨立危險因素，說明血清外泌體miRNA-221-3p的表達水平具有判斷HCC預后的潛在價值。綜上所述，HCC患者血清外泌體中miRNA-221-3p 表達水平明顯上調(diào)，且與臨床病理特征及預后有關(guān)，可能作為HCC患者新型臨床預后的判斷指標。但血清外泌體中miRNA-221-3p在HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制仍需要進一步探索。隨著外泌體提取技術(shù)的發(fā)展及其在分子機制的深入研究，相信外泌體來源miRNA作為惡性腫瘤早期診斷及預后判斷的參考指標具有廣闊的前景。