任秋月，劉 鵬，姚蓉飛，常 柏*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院,天津 300134）

糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，主要以動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）為病理基礎(chǔ)，在前期工作中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大血管病變病理學(xué)改變以纖維化為重[1]。纖維化是由膠原的形成和沉著過量及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)改變導(dǎo)致組織或器官的纖維組織增生。而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissuse inhibitor of metalloproteinase,TIMPs）及二者間的平衡在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝中起著決定性作用[2]。抵擋湯方出于《傷寒論》，原方由大黃、水蛭、桃仁、虻蟲組成，我們?cè)谂R床應(yīng)用中以抵擋湯（水蛭3 g，虻蟲1.5 g，桃仁5 g，熟大黃10 g）干預(yù)后，明顯改善2型糖尿病患者血管內(nèi)皮舒張功能，修復(fù)內(nèi)皮功能損傷，延緩2型糖尿病大血管病變的發(fā)生發(fā)展[3]。本研究擬通過以抵擋湯在糖尿病早期、糖尿病期、糖尿病晚期不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)，探討抵擋湯對(duì)2型糖尿病大血管病變細(xì)胞外基質(zhì)合成、分解平衡的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而改善大血管纖維化的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，普通級(jí)，4周齡，體質(zhì)量（200.5±5.2）g，天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：SCXK津 2014-0001）。自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周納入試驗(yàn)。抵擋湯組成：水蛭3 g，虻蟲1.5 g，桃仁5 g，熟大黃10 g，購(gòu)于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，按傳統(tǒng)工藝制備水煎劑，減壓濃縮至濃度為1 g/mL，4。C保存?zhèn)溆?。氨基胍，美?guó)Sigma公司生產(chǎn)。鹽酸吡格列酮片，日本武田公司，規(guī)格每片15 mg，批號(hào)：J20090134。鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司）；胰島素放免測(cè)定試劑盒（天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司）；pH值4.2的枸櫞酸鈉緩沖液（天津試驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室配制）；MMP-1，MMP-2，MMP-8，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 ELISA試劑盒（上?；顦飞锕荆?；高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、酶標(biāo)儀（450 nm）（MolecularDevices公司）。

1.2 造模與分組 SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其余50只為糖尿病模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，8周后，空腹內(nèi)眥采血測(cè)空腹血糖（FBG）和胰島素（Ins）計(jì)算胰島素敏感指數(shù)ISI=Ln[（FBG）（FINS）]-1，判斷動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗后，隨機(jī)選取糖尿病模型組大鼠10只作為抵擋湯早期干預(yù)組，按人鼠等效劑量予抵擋湯2 g/（kg·d）灌胃4周。12周后，除正常對(duì)照組外，其他大鼠24 h禁食不禁水，尾靜脈注射STZ 30 mg/kg（用前以pH值4.2的0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液配成1%終濃度）。正常對(duì)照組僅注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。3 d后尾靜脈采血測(cè)血糖，隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L視為2型糖尿病大鼠造模成功。造模成功后（除正常對(duì)照組、抵擋湯早期干預(yù)組外）按血糖、體質(zhì)量隨機(jī)分為糖尿病組、抵擋湯中期干預(yù)組、抵擋湯晚期干預(yù)組、氨基胍組、吡格列酮組。

1.3 干預(yù)及標(biāo)本采集 所有干預(yù)組均以體表面積折合成等效劑量給藥。抵擋湯早期、中期、晚期干預(yù)組分別于成模前4周、成模時(shí)、成模后4周予抵擋湯2 g/（kg·d）灌胃；吡格列酮組與氨基胍組成模時(shí)分別給予1.35 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）灌胃。糖尿病組及正常對(duì)照組均予等劑量無(wú)菌飲用水每日灌胃1次。于24周時(shí)結(jié)束飼養(yǎng)并戊巴比妥麻醉下，股動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取上層血清-80 ℃冰箱中保存，用于ELISA法檢測(cè)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）血清解凍后用ELISA試劑盒分別檢測(cè)大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白水平，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)各樣本在酶標(biāo)儀450 nm處的OD值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。2組樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間差異比較采用單因素方差分析，組間方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnet’s T3法。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病大鼠動(dòng)物模型制備 8周后，與正常對(duì)照組相比，糖尿病模型組空腹血糖升高（P＜0.05），胰島素水平升高（P＜0.05），胰島素敏感指數(shù)降低（P＜0.05），表明大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗，高脂喂養(yǎng)糖尿病前期模型大鼠造模成功。見表1。

2.2 不同干預(yù)對(duì)大鼠血糖的影響 抵擋湯干預(yù)各組之間血糖無(wú)顯著差異，表明抵擋湯無(wú)明顯降糖作用；與糖尿病組相比，吡格列酮組血糖明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3 抵擋湯對(duì)大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與糖尿病組相比，抵擋湯早、中期干預(yù)組、氨基胍組及吡格列酮組大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），且抵擋湯早期干預(yù)組MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白水平高于其他藥物干預(yù)組（P＜0.05）。見表3。

表1 實(shí)驗(yàn)第8周大鼠空腹血糖、胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)比較（）

表1 實(shí)驗(yàn)第8周大鼠空腹血糖、胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，# P ＜0.05

表2 各組血糖變化情況（，n =8）

表2 各組血糖變化情況（，n =8）

注：與正常對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05

表3 各組大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）蛋白表達(dá)（，n =8） pg/mL

表3 各組大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）蛋白表達(dá)（，n =8） pg/mL

注：與正常對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05；與抵擋湯早期干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

2.4 抵擋湯對(duì)大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血清中TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與糖尿病組相比，抵擋湯早、中期干預(yù)組、氨基胍組及吡格列酮組大鼠血清中TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05），且抵擋湯早期干預(yù)組TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)顯著低于抵擋湯中、晚期干預(yù)組（P＜0.05）。見表4 。

2.5 抵擋湯對(duì)大鼠血清MMPs/TIMPs比例平衡的影響 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血清中MMPs/TIMPs比例有明顯下降（P＜0.05）；與糖尿病組相比，抵擋湯早、中期干預(yù)組、氨基胍組MMP-9/TIMP-1比值升高（P＜0.05），抵擋湯早、中、晚期干預(yù)組MMP-2/TIMP-2比值升高（P＜0.05）；且抵擋湯早期干預(yù)組MMPs/TIMPs顯著高于抵擋湯中、晚期干預(yù)組（P＜0.05）。見表5。

表4 各組大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）蛋白表達(dá)（，n =8） pg/mL

表4 各組大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）蛋白表達(dá)（，n =8） pg/mL

注：與正常對(duì)照組比，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05；與抵擋湯早期干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

表5 各組大鼠血清MMP-9/TIMP-1，MMP-2/TIMP-2比值（，n =8）

表5 各組大鼠血清MMP-9/TIMP-1，MMP-2/TIMP-2比值（，n =8）

注：與正常對(duì)照組比較，# P ＜0.05；與糖尿病組比較，△P ＜0.05；與抵擋湯早期干預(yù)組比較，▲P ＜0.05

3 討論

糖尿病大血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，糖尿病患者中，大血管病變的患病風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病患者的2～4倍[4]。研究表明，大血管病變?cè)谔悄虿∏捌陔A段已經(jīng)開始出現(xiàn)[5-6]。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病足患者高位截肢的脛后動(dòng)脈轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）表達(dá)明顯增加，管腔出現(xiàn)中、重度狹窄，管壁增厚硬化，內(nèi)膜以纖維性增厚為主，纖維成分所占比例大，中膜鈣鹽散在或者大范圍沉積[1]，提示糖尿病大血管病變病理學(xué)改變以纖維化為重。

血管纖維化表現(xiàn)在過量的ECM沉積，導(dǎo)致血管腔的狹窄及動(dòng)脈壁的增厚。在血管，ECM可形成內(nèi)膜表面的黏附保護(hù)層、內(nèi)膜下層、基底膜、內(nèi)彈力膜、中膜和外膜結(jié)締組織等等，是血管壁的主要成分，包括膠原、蛋白聚糖、纖維連接蛋白、黏連蛋白、彈力蛋白等，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、分化、損傷修復(fù)、血管重構(gòu)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。MMPs是一類含Zn2+的內(nèi)源性蛋白水解酶，可降解ECM中除多糖以外的所有成分[7]。至今發(fā)現(xiàn)的20多種MMPs可分為6類，其中明膠酶類包括MMP-2、MMP-9，主要降解變性膠原蛋白、明膠、Ⅳ型基底膜膠原。間質(zhì)膠原酶類包括MMP-1、MMP-8，作用較廣泛，可降解各類膠原和大部分蛋白多糖核心[8]。研究表明，MMPs參與動(dòng)脈粥樣硬化、結(jié)締組織疾病、腫瘤、冠心病、臟器纖維化的發(fā)生發(fā)展過程[9-10]。TIMPs為MMPs特異性組織抑制因子，能特異性與MMPs催化中心的Zn2+結(jié)合，封閉其催化活性，通過與MMPs共價(jià)結(jié)合，阻斷MMPs的活性作用，形成一個(gè)以ECM為中心的復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的、可調(diào)節(jié)的合成、代謝微環(huán)境。在正常狀態(tài)下TIMPs與MMPs之間維持動(dòng)態(tài)平衡，有助于保持細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡與成分穩(wěn)定[11-12]，一旦平衡被打破，則造成血管EMC的代謝紊亂，MMPs/TIMPs已成為肺[13]、肝[14]、心[15]、腎[16]等器官纖維化的研究和逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)。其中，TIMP-1能特異性抑制MMP-9的活性，而TIMP-2則特異性抑制MMP-2的活性。

Sarper M等[17]研究顯示，在胰腺纖維化的發(fā)展過程中，MMPs/TIMPs比值下調(diào)，促進(jìn)ECM分泌增加。在肝纖維化發(fā)展過程中，TIMP-2增強(qiáng)，抑制MMP-2的活性，導(dǎo)致Ⅳ型膠原含量增多，減少ECM降解。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病大血管病變大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-8、MMP-9蛋白表達(dá)均顯著減少，TIMP-1、TIMP-2表達(dá)增加，MMP-9/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2比值下降，與既往研究一致。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物（TZDs），是目前臨床常用的一類降糖藥物，已有研究表明吡格列酮不僅能改善胰島素抵抗，還可能通過降低血管炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能的途徑來延緩糖尿病患者大血管損傷的進(jìn)展。氨基胍是一種誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑，可通過抑制iNOS產(chǎn)生進(jìn)而能夠調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，本研究采用不同作用機(jī)制保護(hù)血管損傷的藥物作為陽(yáng)性對(duì)照藥，結(jié)果表明2組大鼠血清MMPs表達(dá)量較糖尿病組明顯升高且TIMPs表達(dá)下降，提示二者均可延緩大血管纖維化進(jìn)展，而抵擋湯早期干預(yù)組與此2組結(jié)果無(wú)差異。

2型糖尿病大血管病變屬于中醫(yī)“消渴”變證，氣陰兩虛，陰損及陽(yáng)，漸致痰濁瘀毒等病理產(chǎn)物積聚，絡(luò)瘀脈損，瘀血貫穿于2型糖尿病大血管病變的始終。對(duì)于纖維化，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，瘀血既是纖維化的病理產(chǎn)物，又是病情加重的因素[18-19]，瘀血貫穿于器官纖維化的整個(gè)病程[20]。抵擋湯以善飲血之水蛭為君，善吮血之虻蟲為臣，善破諸經(jīng)瘀血之桃仁為佐，善行君令之將軍大黃為使，破血逐瘀，蕩滌邪熱，推陳出新。以抵擋湯論治，把握了脈絡(luò)瘀阻的主要病機(jī)。本研究以抵擋湯分別在糖尿病早、中、晚期進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示早期干預(yù)可通過上調(diào)MMPs、下調(diào)TIMPs，扭轉(zhuǎn)MMPs/TIMPs比例失衡介導(dǎo)的ECM的合成分解紊亂，改善2型糖尿病大血管病變纖維化。為臨床治療糖尿病大血管病變提供思路，并為中醫(yī)“治未病”提供理論依據(jù)。